分子植物育种，２００６年，第４卷，第１期，第１４３－１４６页ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００６，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．１，１４３－１４６实验方法ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅ一种从香蕉果实提取高质量ＲＮＡ的方法庄军平１苏菁２陈维信１＊１广东省果蔬保鲜重点实验室，华南农业大学园艺学院，广州，５１０６４２；２中山大学生命科学院，广州，５１０２７５＊通讯作者，ｗｘｃｈｅｎ＠ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ摘要从香蕉果实在中分离高质量的ＲＮＡ是从分子水平上研究香蕉果实成熟软化过程中相关基因表达的重要前提。
实验表明，用已报道的相关ＲＮＡ的提取方法，即便利用已报道的从其它果实中成功提取出高质量ＲＮＡ的方法，也不能从香蕉果实中分离出高质量的ＲＮＡ。
这主要是由于香蕉果实富含多糖、多酚和一些其它次生代谢物，在ＲＮＡ提取过程中这些物质会与ＲＮＡ共同沉淀，从而影响ＲＮＡ的产量和质量。
到目前尚无商业化的ＲＮＡ抽提试剂盒适用于香蕉果实ＲＮＡ的提取。
因此，探索出从香蕉果实中提取高质量ＲＮＡ的方法就具有十分重要的意义。
本文所报道的ＲＮＡ提取的简便方法，可从以香蕉果肉和果皮中成功提取高质量的ＲＮＡ，产量可达４８￣７２μｇ・ｇ－１・ＦＷ－１，且整个提取过程可在一天完成；通过测定其Ａ２４０／２６０和Ａ２６０／２８０的比值表明，该该方法可有效降低ＲＮＡ提取过程中多糖、酚类物质和其它次级代谢物以及蛋白质的污染，提取方法所提取的ＲＮＡ纯度较高；在１％琼脂糖凝胶电泳，ＥＢ染色后结果表明ＲＮＡ在整个的提取过程中结构完整，未发生明显降解；利用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从所提ＲＮＡ中成功克隆出了β－半乳糖苷酶基因ｃＤＮＡ片段，这表明其质量完全可满足进一步分子生物学研究的要求。
关键词香蕉果实，ＲＮＡ提取ＡｎＥｆｆｅｃｔｉｖｅＭｅｔｈｏｄｆｏｒＨｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎｆｒｏｍＢａｎａｎａＦｒｕｉｔＺｈｕａｎｇＪｕｎｐｉｎｇ１ＳｕＪｉｎｇ２ＣｈｅｎＷｅｉｘｉｎ１＊１ＫｅｙＬａｂｏｆＦｒｕｉｔａｎｄＶｅｇｅｔａｂｌｅＳｔｏｒａｇｅｏｆＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ，ＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｇｅｏｆＳｏｕｒｔｈＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，５１０６４２；２ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅＣｏｌｌｅｇｅｏｆＺｈｏｎｇｓｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，５１０２７５＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ｗｘｃｈｅｎ＠ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎＡｂｓｔｒａｃｔＨｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙＲＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｆｒｏｍｂａｎａｎａｆｒｕｉｔｉｓａｐｒｅｒｅｑｕｉｓｉｔｅｔｏｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｔｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｅｖｅｌｏｆｂａｎａｎａｆｒｕｉｔｒｉｐｅｎｉｎｇａｎｄｓｏｆｔｅｎｉｎｇ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，Ｐｒｅｖｉｏｕｓａｔｔｅｍｐｔｓｔｏｅｘｔｒａｃｔｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙｔｏｔａｌＲＮＡｆｒｏｍｂａｎａｎａｆｒｕｉｔｓｕｓｉｎｇｐｕｂｌｉｓｈｅｄｐｒｏｔｏｃｏｌｓｈａｖｅｐｒｏｖｅｎｔｏｂｅｕｎｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ，ｅｖｅｎｔｈｅｕｓｅｏｆｐｒｏｔｏｃｏｌｓｄｅｖｅｌ－ｏｐｅｄｆｏｒｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＲＮＡｆｒｏｍｏｔｈｅｒｆｒｕｉｔｔｉｓｓｕｅ．ＲＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｆｒｏｍｂａｎａｎａｆｒｕｉｔｉｓｄｉｆｆｉｃｕｌｔｄｕｅｔｏｂａｎａｎａｆｒｕｉｔｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｌａｒｇｅａｍｏｕｎｔｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ，ｗｈｉｃｈｏｆｔｅｎｃｏ－ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅａｎｄｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｔｈｅＲＮＡｄｕｒｉｎｇｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｔｈｅｒｅｂｙａｆｆｅｃｔｉｎｇｂｏｔｈｔｈｅｑｕａｌｉｔｙａｎｄｑｕａｎｔｉｔｙｏｆＲＮＡｗｈｅｎｕｓｉｎｇｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｐｒｏｔｏ－ｃｏｌｓ．Ｕｎｔｉｌｎｏｗ，ｎｏｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｋｉｔｈａｓｂｅｅｎｄｅｖｅｌｏｐｅｄｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｆｏｒｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙＲＮＡｆｒｏｍｂａ－ｎａｎａｆｒｕｉｔ．ＳｏｏｐｔｉｍｉｚｅｄｐｒｏｔｏｃｏｌｓｆｏｒＲＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｆｒｏｍｂａｎａｎａｆｒｕｉｔａｒｅｎｅｃｅｓｓａｒｙ．ＨｅｒｅｗｅｄｅｓｃｒｉｂｅａｓｉｍｐｌｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｆｏｒＲＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｆｒｏｍｂａｎａｎａｆｒｕｉｔ．ＵｓｉｎｇｔｈｉｓｐｒｏｔｏｃｏｌｗｅｏｂｔａｉｎｅｄｇｏｏｄＲＮＡｙｉｅｌｄ（４８￣７２μｇ・ｇ－１・ＦＷ－１）ｆｒｏｍｂａｎａｎａｆｒｕｉｔｐｕｌｐａｎｄｐｅｅｌｗｉｔｈｌｏｗｌｅｖｅｌｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄｓａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔａｍｉ－ｎａｎｔｓａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＡ２４０／２６０ａｎｄＡ２６０／２８０，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｉｓＲＮＡｗａｓｎｏｔｄｅｇｒａｄｅｄ，ａｓｗａｓｄｅｍｏｎ－ｓｔｒａｔｅｄｂｙｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡｏｆｔｈｅｓａｍｐｌｅｓｏｎ１％ａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．ＲＴ－ＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｃｔｉｎｉｎｔｈｅｓｅＲＮＡｅｘｔｒａｃｔｓａｌｓｏｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅａｒｅｎｏｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓｔｈａｔｉｎｔｅｒｆｅｒｅｗｉｔｈｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐ－ｔｉｏｎｏｒＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎｓ．ＡｌｌｏｆａｂｏｖｅｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｂａｎａｎａＲＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｐｒｏｔｏｃｏｌｐｒｅｓｅｎｔｅｄｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒｃａｎｂｅｕｓｅｄｔｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙｉｓｏｌａｔｅｈｉｇｈｑｕａｌｉｔｙＲＮＡｗｉｔｈｌｏｗｌｅｖｅｌｓｏｆｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｒｅｌａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ．ＫｅｙｗｏｒｄｓＢａｎａｎａｆｒｕｉｔ，ＲＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ分子植物育种ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ从香蕉果实中分离和提纯高质量的ＲＮＡ，并用其构建香蕉果实ｃＤＮＡ文库，通过ＲＴ－ＰＣＲ进行相关基因的克隆、进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交和蛋白质体外翻译试验，是从分子水平上对香蕉果实的形成、发育和果实成熟软化相关基因研究的基础。
虽然已有许多有关从植物中提取ＲＮＡ的方法报道，且有商业化ＲＮＡ提取试剂盒，但都不太适用于从香蕉果实中提取高质量的ＲＮＡ。
这主要是由于香蕉果实中含有大量的多糖、酚类和一些次生代谢物质（Ｌｉｚａｄａｅｔａｌ．，１９９０），这些物质在ＲＮＡ提取过程中不但不易除去，且在除去过程中易导致ＲＮＡ的降解，影响ＲＮＡ的质量（ＺｅｎｇａｎｄＹａｎｇ，２００２），使其不能在体外进行翻译，不能满足进一步实验的要求。
为解决这一问题，我们尝试在提取ＲＮＡ常规方法的基础上进行优化和改进，成功地获得得到了高质量ＲＮＡ。
现介绍如下。
１材料和方法１．１实验材料供试材料香蕉（ＭｕｓａｐａｒａｄｉｓｉａｃａＬ．ｖａｒ．ｓａｐｉｅｎ－ｔｕｍ）购置于广州市番禺区万顷沙镇，采收成熟度为７￣８成熟。
挑选大小均匀、无病虫害及机械伤害的蕉指，用０．１％漂白粉水溶液清洗，再用杀菌剂（０．０５％的施保功）浸泡１￣２ｍｉｎ后晾干，然后在１６℃恒温箱中贮藏。
１．２ＲＮＡ提取试剂提取缓冲液［１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．２）、１．４ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、２０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２％ＣＴＡＢ］，水饱和酚，７０％乙醇，ＤＥＰＣ处理过的水，３ｍｏｌ／ＬＮａＡＣ（ｐＨ５．２），１０ｍｏｌ／ＬＬｉＣｌ，氯仿：异戊醇（２４：１），β－巯基乙醇，无水乙醇。
１．３ＲＴ－ＰＣＲ试剂及引物的合成ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ反转录酶，１５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，０．１ｍｏｌ／ＬＤＴＴ，１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰＭｉｘ，ＴａｋａｒａＬａＴａｑＤＮＡ聚合酶等。
用于ＲＴ－ＰＣＲ扩增的基因为β－半乳糖苷酶，其大小约为１．３Ｋｂ，其引物合成如下。
上游引物：５＇ＧＧ（Ｇ／Ｔ）ＧＧＴＴＴＴＣＣＴＧＴＴＴＧＧＣＴＮＡＡ３＇；下游引物：５＇ＧＣＡＧＴＣ（Ｇ／Ａ）ＧＧ（Ｇ／Ａ）ＡＧ（Ｇ／Ａ）ＡＴＧＣＴＮＡ３＇；其中Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ。
１．４ＲＮＡ的提取（１）分别取３ｇ香蕉果皮、果肉置于液氮中研磨成粉末然后加入６５℃预热的２０ｍｌ的提取缓冲液中（缓冲液预热前加入６μｌ的２－巯基乙醇）。
（２）将离心管在６５℃水浴锅中温浴１ｈ，后冷却至室温，并加入等体积的氯仿：异戊醇（２４：１）在１２０００×ｇ下离心１５ｍｉｎ。
（３）取上清液，再用等体积氯仿：异戊醇抽提，如上离心。
（４）取上清液，加入１０ｍｏｌ／ＬＬｉＣｌ至最终浓度为３ｍｏｌ／Ｌ，在４℃下隔夜沉淀ＲＮＡ，后在１７０００×ｇ下离心２０ｍｉｎ。
（５）将沉淀用ＤＥＰＣ处理过的水溶解，依次用苯酚、苯酚：氯仿（１：１）和氯仿，进行抽提。
（６）将上清液加入１／１５Ｖ的ｐＨ５．２的３ｍｏｌ／ＬＮａＡＣ和１／５Ｖ的无水乙醇，混合后在冰浴上，放置２ｈ，再离心２５ｍｉｎ。
（７）在上清液加入ｐＨ５．２的３ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＡＣ和３倍体积的无水乙醇，使ＮａＡＣ的最终浓度为０．３ｍｏｌ／Ｌ，在－７０℃下放置３ｈ，沉淀ＲＮＡ。
（８）离心２０ｍｉｎ后弃上清，加４℃预冷的７０％乙醇洗涤沉淀，重复２次。
（９）用等体积７０％乙醇洗涤沉淀，后干燥，并将ＲＮＡ悬浮于８０μｌＤＥＰＣ处理过的水中（不宜完全干燥，否则沉淀难以完全溶解），－８０℃冰箱中保存备用。
１．５纯度、产量及完整性检测取４μｌＲＮＡ溶液，稀释至１ｍｌ，后测定２３０ｎｍ，２６０ｎｍ，２８０ｎｍ处的吸光值，即Ａ２３０、Ａ２６０和Ａ２８０，并计算Ａ２６０／Ａ２３０，Ａ２６０／Ａ２８０的比值，确定其纯度，再按照以下公式计算ＲＮＡ回收率：ＲＮＡ回收率（μｇ・ｇ－１・ＦＷ－１）＝（Ａ２６０×４０×稀释倍数×原液体积）／提取样品质量（ｇ）取３μｌ总ＲＮＡ溶液，在１％琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，后在ＱｕａｌｉｔｙＯｎｅ凝胶成像系统下观察并拍照。
１．６ＲＴ－ＰＣＲ分析１．６．１ｃＤＮＡ第一链的合成ｃＤＮＡ第一链的合成采用美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司生产的ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ反转录酶进行，具体操作按产品说明指导书进行。
１．６．２ＰＣＲ反应反应体系（２５μｌ）：１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ［２００ｍｍｏｌ／Ｌ１４４Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．４），５００ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ］：２．５μｌ，５０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２：０．７５μｌ，１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰＭｉｘ：０．５μｌ，上游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）：０．５μｌ，下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）：０．５μｌ，ＴａｋａｒａＬａＴａｑＤＮＡ聚合酶等（５Ｕ／μｌ）０．２μｌ，ｃＤＮＡ第一链１μｌ；加双蒸水至２５μｌ。