《生物工程进展》1997,Vol.17,No.4
绿色荧光蛋白——现代细胞生物学与分子生物学研究领域的新标记物
岳莉莉 齐义鹏(武汉大学病毒学研究所 武汉430072)
摘要 从多管水母属Aequorenvicturia分离出的绿色荧光蛋白(GFP)
,因其特有的生物
化学性质及该基因在异源细胞内的表达产物亦能产生强烈的绿色荧光,使其在现代细胞生物学和分子生物学研究领域的应用具有广阔前景。本文就其研究进展及其应用进行简要综述。关键词 GFP 荧光 基因表达 突变株 应用
基因的表达或蛋白质的定位及时序的变化常需要用荧光物质作为标记。这种标记也是免疫荧光和免疫组化的基础。传统的荧光标记是通过纯化蛋白质再共价结合到荧光染料上,但是化学计量和染料附着的部位难于控制,因此尚需再次纯化。若该蛋白需用于活细胞内检测,最关键的问题是如何使其通过细胞膜。现在可用分子生物学的方法产生荧光蛋白,以取代传统的标记方法。常用的有荧火虫和细菌的荧光素酶基因,但由于它们都需要底物和辅助因子,因而在活体组织中的应用受到限制。由于绿色荧光蛋白所特有的生物化学性质,且该基因在异源细胞内的表达产物亦能产生强烈的绿色荧光,使其在生命科学中的应用具有美好的前景。本文就其研究进展进行简要综述。 一、绿色荧光蛋白的生物发光现象早在六十年代初期,Shimomura等[1]首先从多管水母属(Aequoriavictoria)中分离出一种称为aequoria的蛋白,该蛋白在结合钙离子后可发射蓝光,当时称为光蛋白(photoprotein)。它是分子量为20kD的单一多肽链,在其发光前,1Mol的aequoria结合3Mol的钙离子及1Mol非共价键结合的腔肠动物荧光素。尽管光蛋白体系本身发射蓝光,然而水母整体发光及其提取的颗粒都是呈绿色,推测其粗提液中一定还有一种蛋白即绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)[1,2]。
Morise
等[3]对GFP进行了分离和纯化,他们的实验结果表明,GFP的荧光发射峰在509nm,最大激发波长为395nm,并在475nm处有一肩峰。当将Ca2+加入到含低浓度GFP的aequorin溶液中时,光谱接近于aequorin发射的蓝光(Κmax
472nm);而将aequorin和GFP
按大自然比例
混合时,加入Ca
2+
,则光谱接近于活体的发射
光(Κmax509nm
)。推测在活体内
,GFP
通过荧
光素酶或钙活化光蛋白的能量转换过程,吸收蓝光而后发出强烈的绿色荧光。Aequorea发光系统分子间的能量转换过程如下:
AequorinCa2+BFP3+blueLightGFP↓激发GFP3+
greenlight(BFP为蓝色荧光蛋白)
二、GFP的生色基团从jellyfishAequoreavicioria分离出的GFP分子量约27230kD,为一单链多肽,它的生色基团(chromophore)
在各种苛性条件下
(如热、极端pH、化学变性剂)都很稳定,比如用
04酸、碱、或盐酸胍处理,一旦恢复中性pH环境,
或是除去变性剂,荧光就可恢复并具有和原来一致的发射光谱[5,6]。绿色荧光蛋白独特的生物化学性质暗示它含有特殊的结构,它的生色基团和另外一种荧光蛋白——藻胆蛋白(Phyco2biliproteins)的生色基团完全不同,它是由链内几个被修饰的氨基酸残基经共价键连接而成。最初由Shimomura提出,并被大家所公认的生色基团化学结构见图1[7,8]。
图1.AequoreaGFP的生色基团化学结构示意图 构成生色基团的3个氨基酸:Ser-dehy2droTyr-Gly位于第65—67位,生色基团由丝氨酸—脱水络氨酸—甘氨酸形成的对羟苯甲基咪唑环酮(42P2hydroxybene252imidazolinone)构成,其上游第8个氨基酸为色氨酸,不寻常的是这个色氨酸的荧光是检测不到的,可能是它和生色基团之间的能量转移阻抑了色氨酸荧光(320—350nm),这个色氨酸附近有多个脯氨酸残基(Pro2Val2Pro2Try2Pro),它的重要性现在还不明了,但从蛋白质数据库(PIRver25;Swiss2Protver14)中只找到细胞色素P2450蛋白具有这种结构[9]。 三、GFP基因的克隆及特征为了探索GFP发光的奥秘,传统的生物化学技术一直没有得到满意的答案,进入九十年代,采用分子生物学手段研究GFP,才使其有了重大突破。1992年,Prasher等[9]根据GFP的氨基酸序列合成了相应的寡核苷酸片段,以此作探针从A.Victoria的cDNA文库[10,11]中筛选出了gfp的几个阳性克隆,并对EcoR1片段的全序进行了分析,该序列有三个特征:1.此cDNA共有965个核苷酸,而用Northernblot证实的gfpmRNA全长是1105kb。215′末端非编码区很短,只有26个核苷酸。31无Poly(A)
尾,而gfpmRNA则有Poly(A)
尾。从
cDNA
的序列推算:gfp含有一个开放阅读框,编码238个氨基酸,分子量为26888kD,同经SDS—PAGE测定的天然GFP的分子量(27230kD)比较接近。由于用来构建基因文库的A.victori2
a基因组DNA来自于大量的jellyfish组织,电泳纯化的GFP显示至少有三种主要的同分异构体,其紫外吸收率(A395A280)均在1110～
1125[8]。根据限制性酶切和Southernblot分析
这些阳性克隆,也发现至少存在有三种不同的内切酶图谱,因而可能存在三种不同的gfp基因,见图2。与前述的gfp序列相比,gfp2基因在216kb的DNA片段上,至少有3个外显子(、、),分别编码69、98和71个氨基酸,推测在该基团组的上游可能还有一个外显子。生色基团的氨基酸残基位于外显子的3′末端。目前尚不清楚这些cDNA是否来源于不同的gfp
基因,但它们的核苷酸和氨基酸确有不同之处。见表1。
14图2.三种Aequoreagfp基因的限制性酶切图谱双线代表可与gfpicDNA杂交的DNA片段
表1 不同gfp克隆编码区序列比较A.与gfp2基因不同的核苷酸序列B.氨基酸不同处
aa位置gfp2基因gfp10基因gfp1基因gfp10cDNA12(8个沉默)100TyrPheTyrgfp1cDNA2(2个沉默)108SerThrSer141MetLeuMet
219IleVal
四、发光机制的研究GFP基因的克隆为探索GFP的发光机制打下了坚实的基础。人们很自然地想到GFP在异源细胞内能否形成生色基团?在受到激发后能否产生特征性的绿色荧光?1994年2月Chalfie等人[12]以“绿色荧光蛋白作为基因表达的标记”为题在Science上发表了他们在大肠杆菌和线虫体内表达GFP的初步结果,当期的封面也登载了他们的照片。通过测定重组GFP的荧光光谱发现,它和提纯的天然GFP光谱完全一致。随着GFP基因分别在大肠杆菌[12,13]、线虫[13]、酵母[14]、果蝇[15]、昆虫细胞[16]和cos细胞[17]内的表达成功,说明GFP的生色基团在没有A.victoria其它产物存在的异源细胞内可以自发形成,其发光不需要特殊的辅助因子参与。但是荧光形成的机制究竟是什么?荧光的产生与蛋白质的结构有何关系?荧光的特性能否被改变?依然亟待解决。为了解决这些问题,
Heim等[18]将GFP基因的编码区插入到
pGE2
MEX22表达质粒T7启动子下游并诱导其表
达,在不同的时间和条件下测定重组GFP的荧光谱,结合SDS2PAGE分析,提出其发光机制如下:
翻译后的GFP前蛋白在有氧条件下,Gly267位与Ser265的羧基环化形成第5位碳原子上的咪唑基,新的N=C双键促其脱氢连接成生色基团,第5位碳上的咪唑基再自身氧化与第4碳形成双键,从而构成完整的生色基团。它24的自身环化与氧化过程见图3。图3.GFP生色基团的生物合成机制示意图[17] 虽然Aequorea和Renilla的GFP有相同的生色基团,且有相同的发射光谱(Κmax509nm),但两者的吸收光谱不同(Aequarea的GFP有两个吸收峰:395nm和475nm,而Re2nilla的GFP只有一个:498nm,其消光系数比前者高出10倍)。Ward[19]认为不同的吸收光谱是其分子微环境不同造成的。已知Aequorea的GFP是30kD的单体,而RenillaGFP为54kD的二聚体。在实际应用中发现,RenillaGFP的长波激发优于AequoreaGFP,但尚未得到Reniliagfp基因的克隆。然而AequoreaGFP长波吸收峰(475nm)的优点是有较大的光稳定性,且更适合于标准的荧光滤镜,缺点是振幅较低。为了增强荧光亮度使它更适合于应用,Heim等[16]用羟胺(hydroxylamine)处理使
GFPcDNA随机突变,或在PCR扩增GFP编码区时加入MnCl2增加其错配率,将产物再插入pGEMEX22表达质粒,从中筛选出3个有意义的突变株:H9在398nm处、P9和P11在471nm
处的荧光强度增加。这些突变株的单个
氨基酸替换均位于GFPC′末端,远离生色基团;而第4个突变株:P4用紫外光激发,可产生鲜艳的蓝色荧光,它是由于生色基团中心的Try266变成了His266的缘故,见表2。
表21AequoreaGFP突变株的特性GFP突变最大吸收波长(nm)最大发射波长(nm)相对荧光强度(%)野生型无396(476)508(503)100
H9突变株Ser202→PheThr203→Ile398511117P9突变株Ile167→Thr471(396)502(507)166P11突变株Ser167→Thr471(396)502(507)188P4突变株Tyr66→His38244857W突变株Tyr66→Trp458480(未测)
考虑到Ser65位于生色基团2对羟苯甲基咪唑环酮的氨基端,为了证实Ser65在脱氢形成乙烯基侧链假说中的作用[20],他们于1995年又在Nature上发表了实验结果[21]。出乎意外的是,当将Ser65分别突变成Ala、Leu、Cys
或Thr,都在470—490nm处有单一的吸收峰,
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