人类K-ras基因突变检测试剂盒说明书 人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）说明书 【产品名称】 通 用 名：人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）
英 文 名：Diagnostic kit for Mutations of Human K-ras Gene (PCR-Melting Curve Analysis)
【包装规格】 20测试/盒 【预期用途】 K-ras基因位于12号染色体短臂上，是重要的癌基因之一，编码一种21kD 的kras蛋白，参与细胞内的信号传递，主要包括PI3K/PTEN/AKT 和 RAF/MEK/ERK信号转导途径，这些转导途径是当前肿瘤靶向药物研究的热点，靶向药物通过抑制这些途径发生药理作用。K-ras基因第12和13密码子发生突变，将导致kras蛋白变异并处于持续激活状态，使药物失效。。据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》，在一项包含101例肺腺癌亚型细支气管肺泡癌 患者的回顾性研究中，所有患者均接受厄洛替尼单药一线治疗。K-ras突变者无一例缓解（0/18），而无K-ras突变者则有20例缓解（20/62，32%），差别有统计学意义（P <0.01）。因此，指南建议，非小细胞肺癌和结直肠癌患者使用靶向药物前应进行K-ras基因突变状态的检测。
本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于检测肿瘤组织K-ras基因第12，13密码子的12种体细胞突变（表1），提供突变状态的定性结果。为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供辅助诊断依据，本品适用于进入个体化靶向治疗疗程前的患者使用。 1）。 【主要组成成份】 本试剂盒包含PCR反应液I、PCR反应液Ⅱ和野生型对照品等3管试剂。PCR反应液I包含相应的K-ras基因突变检测引物和探针，探针由FAM荧光指示；PCR反应液Ⅱ含有dNTP、Taq酶和MgCl2等。 检测必须但试剂盒中不包含的组分： 1.5ml 离心管（用于配制PCR反应液和DNA提取）；0.2ml PCR管或8联PCR管或96孔PCR板； 带滤塞的吸头（1ml、200μl和10μl）；
DNA提取试剂盒ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System（货号：A2352）
【贮存条件及有效期】 置于-20℃条件下储存，有效期6个月。4-10℃避光条件下储存或运输不得超过7天。
【适用仪器】 适用于ABI7500、Linegene FQD-96A型号的Real-time PCR扩增仪。 【样本要求】 1. 适用样本为非小细胞肺癌、结直肠癌石蜡包埋病理组织切片，切片厚度10μm，数量1片，所用切片样品保存不超过3年。
2. 由于肿瘤的复杂性，所采集的临床样品往往会混有正常组织细胞，石蜡包埋病理切片样品肿瘤病变细胞
应不低于 %，所取部分应尽量在蜡块中部；
3. 使用商业化的试剂盒来提取人类基因组DNA，推荐使用Promega公司的ReliaPrep™ FFPE gDNA
Miniprep System（A2352）提取石蜡包埋组织切片样品，所提DNA需用紫外分光光度计测定浓度和纯度，其DNA OD260/OD280的值应在1.8~2.0，浓度应在3~300ng/μl之间，样本DNA质量不合格者不得用于检测，建议重新取切片进行核酸提取，提取完的DNA建议立即进行检测，否则请于-20℃以下保存，保存时间不要超过6个月。 【检验方法】 一、 核酸提取（样本处理室） 使用ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System进行核酸提取，提取步骤如下。
1. 用矿物油去除石蜡 加矿物油500µl到装有组织切片样本的1.5ml离心管内，80℃孵育1min，振荡混匀；
2. 组织样本裂解，消化组织蛋白质 1) 离心管内加入200µl裂解液，室温10,000g离心15s,形成水油两相溶液，下层为水相，上层为油相；
2) 向离心管水相加入20µl蛋白酶K, 用移液枪吸打混匀； 3) 56℃孵育1h； 4) 80℃孵育1h；
5) 冷却到室温，离心15s； 3. 去除RNA 向离心管水相加入10µl RNase A，吸打混匀。室温（20-25℃）孵育5min； 4. 用核酸提取柱提取基因组DNA1) 加入 220µl BL Buffer到含裂解样品的离心管中，再加入240µl乙醇（95-100%），震荡混匀，室温10,000g离心15s，形成水油两相溶液，下层为水相，上层为油相；
2) 将结合柱置于收集管内，小心吸取离心管下层水相（包括可能形成的沉淀）转移到结合柱内，盖上管盖，将离心管丢弃。
3) 收集管室温10,000g离心30s，弃去管中的滤出液。
4) 把柱子重新装入收集管中，加入500μl 1 洗涤液至柱内，室温10,000g离心30 s，弃去滤出的洗涤液。 5) 重复步骤4）再洗涤一次；
6) 打开结合柱盖子，室温条件下16,000g离心3 min以甩干柱内残余的液体；
7) 把柱子转移至一个干净的自备1.5ml离心管中，向柱内加入50μl Elution Buffer，室温16,000 g 离心1 min
洗脱基因组DNA，丢弃提取柱。 注意事项： 1. 操作提取柱和收集管时应戴好一次性手 套； 2. 收集基因组DNA前的16,000g离心3 min操作必须开盖，以除净乙醇，乙醇残留过量将严重影响基因组的收集质量。
二、 试剂准备（试剂准备室） 将试剂从冰箱取出，室温融化，混匀，1000rpm快速离心20秒，备用；
三、 反应体系配制（试剂准备室） 1. 根据检测样本数计算所需反应数，如样本数为n，则需做n+2个反应（包含一个阴性对照反应和一个
无模板对照反应）； 2. 根据表3计算所需各反应液的体积，并配制反应体系，反应体系混匀后3000rpm快速离心30秒，分装至PCR管中，每管18μl； 四、 加样（样本处理室） 取2μl提取的样品DNA加入PCR反应管，盖上管盖，1000rpm离心或轻甩，排除管底气泡；阴性对照反应所用模板为试剂盒中野生型对照品，空白对照反应所用模板为超纯水（自备）。
五、 上机检测（扩增室） 1. 将PCR管按顺序放入PCR仪，设置反应程序
（1） LineGene FQD-96A荧光定量PCR仪程序设置 在52℃时收集荧光，荧光检测通道选择FAM检测通道，获得扩增曲线及Ct值，实时监测反应进程。
Melt分析时，目标温度65℃，起始温度39℃，台阶温度1℃，台阶温度维持30s，荧光采集方式为“台阶”。荧光检测通道选择FAM检测通道。
（2） ABI7500荧光定量PCR仪 Melt分析时，选择StepAndHold模式，温度39～65℃，每个步骤升高0.3℃，在每个温度都收集荧光。荧光检测通道选择FAM检测通道。
2. 运行PCR反应程序，保存文件。 六、 结果获取 荧光定量PCR仪运行结束后，使用配套软件对本次试验的结果进行熔解曲线导数图（-dF/dT）分析。
【参考临界值】 以野生型对照品反应管为参照，以野生型对照峰峰高的1/5划定阈值线。
【检验结果的解释】 1. 空白对照在Linegene FQD-96A中应无明显熔解峰，若分析后出现明显熔解峰，可能为试剂受到污染或操作过程中的污染，请排除污染源后重新检测；在ABI7500中，空白对照荧光变化曲线（Normalized Reporter）应为逐渐上升的一条斜线（如图4），若出现荧光值下降的熔解特征曲线，可能为试剂受到污染或操作过程中的污染，请排除污染源后重新检测； 2. 野生型对照管在熔解曲线分析后应有单独熔解峰，若野生型对照管无熔解峰，或出现2个或2个以上熔解峰，该批次样本需重新检测。请确认所使用的试剂是否仍在有效期内，确定操作是否严格按照说明书进行。
3. 若满足1和2要求，表明此次实验成功，对样品管进行分析：
（1） 样品管只出现单独熔解峰，且Tm值在野生型对照管熔解曲线峰Tm±1范围内，该样本判定为阴
性（野生型），如图5野生峰； （2） 样品管只出现单独熔解峰，且Tm值小于野生型对照管熔解曲线峰Tm值3℃以上，则该样本判定
为阳性（突变型），如图5突变峰； （3） 样品管出现两个熔解峰，且两个熔解峰分别符合（1）和（2）的要求（如图6A），或样品管出现
一个宽峰（左右各有一个高点，可以判为峰值，但两峰间平缓过渡，凹陷不明显，见图6B、C和 D），则该样本判定为阳性（突变型）； （4） 一般情况下不会出现突变峰与野生峰位置相差3℃以内或单一突变峰与野生型对照管的野生峰位
置相差1~3℃的情况，如确实发生此种情况，考虑仪器温度控制和传感系统是否发生故障； （5） 样品管在熔解曲线分析中无明显熔解曲线峰，可能为DNA样本中存在PCR抑制剂或DNA量不够，请确认样本质量以及前处理过程是否规范，必要时再行检测。