南方医科大学硕士学位论文登革病毒E蛋白的生物信息学分析，B细胞和T细胞表位的研究姓名：仲华申请学位级别：硕士专业：病原生物学指导教师：曹虹;赵卫20080601硕士学位论文登革病毒Ｅ蛋白的生物信息学分析，Ｂ细胞和Ｔ细胞表位的研究

硕士研究生：仲华指导教师：曹虹教授，赵卫副教授

摘要登革病毒（Ｄｅｎｇｕｅｖｉｒｕｓ，ＤＥＮ）为单股正链ＲＮＡ病毒，是急性蚊媒传染病一

登革热的病原体，属于黄病毒科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）黄病毒属（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）。登革病毒基因组长约ｌｌｋｂ，由单一的开放读码框架依次编码３个结构蛋白（ＰｒＭ，，Ｍ、Ｅ和Ｃ）和７个非结构蛋白。按生物学和免疫学特性分为ＤＥＮ．１、ＤＥＮ一２、ＤＥＮ．３和ＤＥＮ．４四种血清型。各血清型均可引起登革热（Ｄｅｎｇｕｅｆｅｖｅｒ，ＤＦ）和致死率很高的登革出血热（Ｄｅｎｇｕｅｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｆｅｖｅｒ，ＤＨＦ）以及登革休克综合征（Ｄｅｎｇｕｅｓｈｏｃｋｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＤＳＳ）。南太平洋和东南亚地区几乎每年爆发登革热，其流行趋势也日益严峻，尤其是近期发生在巴西等地逾３万人感染的大规模流行，使得登革疫苗的研制受到人们的密切关注，但目前登革的预防主要依赖于切断蚊媒传播，尚无有效的疫苗用于其预防。登革疫苗研制的主要困难在于：一、ＤＨＦ／ＤＳＳ的发病机理（尤其是Ｂ细胞和Ｔ细胞免疫反应效应）尚未明确，多种假说如二次感染时可能存在的抗体依赖的感染增强作用（Ａｎｔｉｂｏｄｙｄｅｐｅｎｄａｎｔ

ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，ＡＤＥ）假说、病毒毒力假说

和免疫病理学假说未获一致认可。ＡＤＥ效应学说认为感染ＤＥＮ后，Ｂ细胞表位可刺激Ｂ淋巴细胞产生中和抗体和增强感染并导致ＤＨＦ／ＤＳＳ的非中和抗体，而免疫病理学说认为异常的Ｔ细胞免疫反应和异常的细胞因子也参与了ＤＨＦ／ＤＳＳ的发病，即Ｔ细胞免疫诱导机体产生ＤＥＮ型特异性Ｔ细胞和血清型交叉反应性Ｔ细胞；前者保护机体免受同型病毒再次感染后者除了清除病毒也参与ＤＨＦ／ＤＳＳ发病。中文摘要诱生中和抗体和非中和抗体的Ｂ细胞表位的尚未区分以及产生保护性细胞免疫的ＤＥＮ型特异性Ｔ细胞表位的尚未鉴定严重阻碍了ＤＥＮ疫苗研发；二、没有可供使用的ＤＥＮ感染动物模型以模拟ＤＨＦ／ＤＳＳ的发病过程；三、研制的疫苗需针对四个血清型的ＤＥＮ感染有全面的保护作用，增加研制难度；四、常规疫苗因研制周期长、产量低和潜在的副作用限制其应用。新型的表位多肽疫苗是目前研发的ＤＥＮ疫苗的新方向，它是基于Ｂ细胞表位或Ｔ细胞表位合成的多肽，既能激活Ｂ细胞产生特异性抗体，保护机体免受特异病原的攻击，又能激活ＣＴＬ（细胞毒性Ｔ淋巴细胞ＣＤ８＋Ｔ细胞）清除病毒感染的靶细胞，也能激活ＣＤ４＋Ｔ细胞辅助体液免疫应答。常规疫苗如亚单位疫苗、嵌合体疫苗等多以Ｅ蛋白为其靶位，因为Ｅ蛋白是病毒体最大的结构蛋白和主要包膜糖蛋白，构成病毒粒表面的突起。它决定着病毒的组织嗜性，介导病毒与细胞受体的结合，同时它还影响病毒毒力、引起保护性免疫反应和免疫病理损伤。因此我们在本课题中以Ｅ蛋白作为研究靶位，以期通过筛选并鉴定Ｅ蛋白上潜在的型特异性保护性Ｂ细胞和Ｔ细胞抗原表位从而为表位多肽疫苗研制提供重要信息。Ｅ蛋白结构与功能的研究也一直是人们关注的焦点，近年来，通过生物信息学及序列分析软件的预测，可获得基因和蛋白质序列中蕴含的重要的信息，本文综合利用网络服务器、数据库及生物信息学软件对登革２型病毒国际标准ＮＧＣ株Ｅ蛋白的理化性质、二级结构、穿膜螺旋、结构域、空间结构、柔韧性、表面可及性、亲水性等参数进行生物信息学的分析，可全面了解Ｅ蛋白与病毒感染、毒力和免疫相关的结构特征，同时运用新型表位多肽疫苗的研究策略，预测Ｅ蛋白Ｂ细胞和Ｔ细胞抗原表位所在位置，并运用体外免疫学实验加以筛选和鉴定。

一、登革２型病毒Ｅ蛋白的生物信息学分析根据ＤＥＮ２ＮＧＣ株Ｅ蛋白氨基酸序列（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓＮｕｍｂｅｒ：

ＢＡＡ００２５５），利用在线的网络服务器ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ经Ｔａｇｌｄｅｎｔ程序分析登革病毒Ｅ蛋白分子量，等电点；经ＡＡＣｏｍｐｌｄｅｎｔ程序分析，可得到Ｅ蛋白各硕士学位论文氨基酸所占比例。运用ＤＮＡｓｔａｒ软件包中Ｐｒｏｔｅａｎ软件的Ｃｈｏｕ．Ｆａｓｍａｎ和Ｇａｍｉｅｒ－Ｒｏｂｓｏｎ方法分析Ｅ蛋白的ａ螺旋、ｐ折叠、ｐ转角和Ｃｏｉｌ卷曲所在区段。服务器ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ中分别使用ＴＭＨＭＭ软件和ｓｉｇａｌＰ２．０软件分别预测Ｅ蛋白的穿膜螺旋和信号肽切割位点，可知蛋白在第４４３＂－４６５位氨基酸和第４７２＂－＇４９４位氨基酸之间有两段穿膜结构而Ｅ蛋白并无信号肽切割位点。在免疫信息学网站ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ中分别采用Ｋａｒｐｌｕｓ＆Ｓｃｈｕｌｚ、Ｅｍｉｎｉ及Ｐａｒｋｅｒ方法分别对柔韧性、表面可及性及亲水性进行分析。通过三种方案的综合运用，发现三种参数所位于的氨基酸区段较多而且较为密集，其中表面可及性和亲水性皆可获得较高的分值。运用ｐｅｐｗｈｅｅｌ程序对Ｅ蛋白肽链作螺旋状轮图，识别疏水和亲水的区域，显示序列螺旋的横切面，反应序列的性质。Ｅ蛋白的肽轮状图可显示疏水性氨基酸；．所占比例较大，与Ｅ蛋白为包膜蛋白符合。在Ｐｒｏｓｉｔｅ数据库中分析Ｅ蛋白的结构域（Ｄｏｍａｉｎ）和空间结构可知Ｅ蛋自由３个Ｄｏｍｍｎ组成，其中ＤｏｍａｉｎＩ所在的氨基酸区段为第１＂－５２，３２～１９１

和２７８＂－－＇２９４位氨基酸。ＤｏｍａｉｎＩＩ所在的氨基酸区段为第５３，－－，１３１和１９２＂－２７７位氨基酸，而ＤｏｍｍｎＩＩＩ所在的氨基酸区段为第２９４＂－＇４９３位氨基酸。预测所得７到的激酶的磷酸化位点是信号转导的重要通路，糖基化位点可能是登革病毒包膜糖蛋白Ｅ潜在的修饰位点。Ｅ蛋白在成熟的病毒颗粒中被包装并排列成紧密的鲱鱼骨架形态，包含３０个类似救生筏状的结构，每个筏状结构由３个平行的二聚体组成。

二、登革２型病毒Ｅ蛋白的Ｂ、１ｌ细胞表位分析和多肽设计在哈佛大学网站ｈｔｔｐ：／／ｍｉｆ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ采用Ｋｏｌａｓｋａｒ＆Ｔｏｎｇａｏｎｋａｒ进行Ｂ细胞抗原表位的预测。Ｅ蛋白的Ｂ细胞抗原趋势最高分值为１．２５５，位于第４８１位氨基酸残基亮氨酸（Ｌｅｕ）上。在第２５、６０、１２０、１４０、２２０、２５０、３２０、４５０和４９０左右的氨基酸存在几个Ｂ细胞抗原趋势值较高的区域。

利用免疫信息学网站ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／提供的软件ＰｒｏＰｒｅｄ．Ｉ和

ＩＩＩ中文摘要Ｐｒ０Ｐｒｅｄ和在哈佛大学网站ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＲＡＮＫＰＥＰ／提供的软件Ｒａｎｋｐｅｐ分别进行ＨＬＡ．Ｉ和ＨＬＡ．ＩＩ类分子限制性的Ｔ细胞表位进行预测；并从中选择在我国ＨＬＡ基因分布频率最高的等位基因进行预测。综合ＰｒｏＰｒｅｄ—Ｉ、ＰｒｏＰｒｅｄ和ＲａｎｋｐｅｐＴ细胞表位预测三种软件和用于预测Ｂ细胞表位的Ｋｏｌａｓｋａｒ＆Ｔｏｎｇａｏｋａｒ方法的结果获得Ｔ细胞和Ｂ细胞候选抗原表位。综合Ｂ细胞和Ｔ细胞表位分析的结果，设计并送广州杰特伟生物有限公司合成，运用Ｆｍｏｅ－ｂｕｔｙｌ固相合成侧链保护策略，在ＡＢＩ多肽合成仪上合成抗原多肽，ＨＰＬＣ纯化和分析。得到两条登革２型病毒合成肽Ｐ１和Ｐ２，均为１５个氨基酸，具体序列为ⅪⅣＬＧＲＬＩｎ小ＰＩＶＴＥ３４５～３５９；ＥＰＧＱＬＫＬＮＷＦＫＫＧＳＳ

Ｅ３９３～３９７；纯度分别为９４．９７％；９９．１７％。同时合成一条登革ｌ型病毒的多肽作为对照（序列为ＱＨＧＴＶＬＶＱＶＫ，Ｅ３１６￣３２５），纯度为８７％。

三、登革２型病毒候选Ｂ细胞和Ｔ细胞表位多肽免疫学的研究合成肽的动物学实验：合成肽偶联载体蛋白分别与其相应组的小鼠在免疫前、第２次免疫以及末次免疫后，随机抽取的８只小鼠经间接ＥＬＩＳＡ法检测在一系列稀释度下的ＯＤ盯咖值，绘制免疫前、２次免疫后及未次免疫后的曲线变化图。合成肽的特异性实验：间接ＥＬＩＳＡ法检测将合成肽分别与已感染登革２型病毒的小鼠血清、小鼠多抗腹水及正常小鼠血清进行ＥＬＩＳＡ反应并检测其ＯＤ值，统计学处理采用ＳＰＳＳｌ３．０软件进行单因素方差分析。经单因素方差分析（Ｏｎｅ．ｗａｙＡＮＯＶＡ），合成肽Ｐｌ、Ｐ２分别与已感染登革２型病毒的小鼠血清、小鼠多抗腹水及正常小鼠血清进行ＥＬＩＳＡ反应的ＯＤ值之间的差异有统计学意义（Ｆ＝５０．８０７，Ｐ＝０．０００；Ｆ＝２３２．０５０，Ｐ＝０．ｏｏｏ）。合成肽的血清学实验：间接ＥＬＩＳＡ法检测合成肽与１０份Ｊ下常人血清及登革病毒感染恢复期患者血清的反应，统计学处理采用ＳＰＳＳｌ３．０软件进行两样本ｆ检验。经两样本ｔ检验，合成肽Ｐ１、Ｐ２分别与恢复期患者血清及正常人血清的

ＩＶ硕士学位论文ＥＬＩＳＡ结果比较，差异有统计学意义（产８．３７４，Ｐ＝０。０００；ｔ＝６．５０４，Ｐ＝０．０００）。合成肽的ＥＬＩＳＰＯＴ实验：建立登革病毒感染小鼠模型后，分离小鼠脾脏淋巴细胞，采用酶联免疫斑点（ＥＬＩＳＰＯＴ）实验用ＩＦＮ吖ＥＬＩＳＰＯＴ试剂盒检测抗原表位多肽能否刺激机体产生细胞免疫，刺激Ｔ淋巴细胞分泌细胞因子如ＩＦＮ－１，，记数斑点形成细胞即ＩＦＮ．丫分泌细胞数量，统计学处理采用ＳＰＳＳｌ３．０软件进行析因设计的方差分析，确定抗原多肽是否为ＤＥＮ型特异性Ｔ细胞表位。ＩＦＮ吖ＥＬＩＳＰＯＴ试剂盒检测ＩＦＮ吖生成细胞，接种病毒组比正常组产生较多ＩＦＮ吖生成细胞，正常组产生细胞为０／１ｘ１０５个细胞，且接种病毒组中合成肽刺激组ＩＦＮ吖生成细胞数目为１５￣４５／ｌ×１０５个细胞和１１３～１８０／４ｘ１０５个细胞，与无肽刺激组（空白对照）、无关多肽刺激组（阴性对照）和ＰＨＡ刺激组（阳性对照）相比，差异有统计学意义。因无肽刺激组（空白对照）和无关多肽刺激组（阴性对照）的斑点数量均为０，故比较在两种细胞浓度下，另外两种不同处理ＰＨＡ刺激组（阳性对照）和实验组（合成肽Ｐｌ刺激组）的ＥＬＩＳＰＯＴ数目的差异。析因分析结果表明，两种不同处理的主效应即合成肽Ｐｌ刺激组与ＰＨＡ刺激组间差异有统计学意义（Ｆ＝９８４８．８１８，Ｐ＝０．０００）；两种细胞浓度的主效应有统计学意义（庐１３６７．７１７，Ｐ＝－０．０００）；不同处理组问和细胞浓度的交互效应有统计学意义（Ｆ＝１７．０８１，Ｐ＝０．０００）。以上结果表明，我们的筛选设计并合成的合成肽ＰＩＥ３４５～３５９在表位预测软件中Ｂ细胞表位和Ｔ细胞表位预测均获得较高分值，经生物信息学分析其可能同时包含Ｂ细胞和Ｔ细胞表位，同时合成肽Ｐ２Ｅ３ｓ３￣３孵也在Ｂ细胞表位预测软件中预测为潜在的Ｂ细胞表位，而在体外免疫学实验研究中，应用ＥＬＩＳＡ方法检测的动物学实验、特异性实验和血清学结合实验中两合成肽Ｐ１、Ｐ２均比对照组具有良好的免疫原性、特异性和结合性，在ＥＬＩＳＰＯＴ实验中，，合成肽Ｐ１也能良好地诱发Ｔｈｌ型细胞免疫并刺激已感染ＤＥＮ并获得免疫记忆的小鼠脾脏Ｔ淋巴细胞分泌较高水平的ＩＦＮ吖，与阴性对照、空白对照和阳性对照的差别有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０１）。