河北农业科学,2009,13(5):34-36,85JournalofHebeiAgriculturalSciences󰀁编辑󰀁白瑞霞

水稻成熟胚不同接种方式对愈伤组织诱导的影响

吕孟雨,王海波*,高义平󰀁(河北省农林科学院遗传生理研究所,河北省植物转基因中心,河北石家庄󰀁050051)

摘要:采用4种不同的接种方式,对3个水稻品种的成熟胚进行了愈伤组织诱导试验。结果表明:在胚上纵切

1刀,将种子接种在培养基上的接种方式,愈伤组织诱导率最高、出芽率最低,且愈伤组织质量最好,可以在

短时间内获得大量胚性愈伤组织,建立悬浮系,其愈伤组织在较短的时间即可分化出再生植株,是1种简单、

方便、效果好的诱导水稻愈伤组织的理想方法。

关键词:水稻;成熟胚;接种方式;组织培养

中图分类号:S511󰀁󰀁󰀁文献标识码:A󰀁󰀁󰀁文章编号:1008󰀁1631(2009)05󰀁0034󰀁03

EffectsofInoculationMethodsofRiceMatureEmbryoonCallusInduction

LVMeng󰀁yu,WANGHai󰀁bo*,GAOYi󰀁ping

(InstituteofGeneticandPhysiologyofHebeiAcademyofAgricultureandForestrySciences,HebeiCenterofPlantGenetic

Transformation,Shijiazhuang󰀁050051,China)

Abstract:Thematureembryosofthreericevarietieswereinoculatedbyfourmethodsforcallusinduction󰀂Theresults

showedthattheinoculationmethodofcuttingtheembryoandinoculatingtheseedonthemediumwasaidealmethodfor

inducingricecalluseasily,convenientlyandeffectivelywiththehighestcallusinductionrate,thelowestshootingrate

andthebestcallus󰀂Alargenumberofembryogeniccallicouldbeobtainedandtheplantscouldberegeneratedinashort

tmieusingthismethod󰀂

Keywords:Rice;Matureembryo;Inoculationmethod;Tissueculture

收稿日期:2009󰀁04󰀁15作者简介:吕孟雨(1963-),男,河北晋州人,研究员,硕士,主要从事生物技术研究。通讯作者:王海波研究员,博士。󰀁󰀁关于水稻组织培养,前人有过许多研究,已有用根

尖、节、盾片、叶鞘、胚芽鞘、花药、胚囊、幼胚、叶

片和幼穗等[1]组织成功进行离体再生培养的报道,但上

述取材多受季节和环境限制,难以满足常年试验的要

求。越来越多的研究者开始以水稻成熟种子作为受体材

料,期待从成熟种胚中诱导出高质量的愈伤组织[2]。郑

文静等[3]以成熟胚、幼胚、幼穗及花药为外植体,进行

水稻组织培养,考察同种培养条件下4种外植体的愈伤

组织诱导率和诱苗率,并调查各种方法所获后代的有利

变异率,结果显示,以成熟胚为外植体时,愈伤组织诱

导率最高。以有生活力的成熟种子进行培养,由于在选

择培养时间上具有较大的灵活性,在操作上也具有简便

性,因而应用得较多[1]。水稻遗传转化主要以具有强增

殖能力和高分化能力的愈伤组织为受体转移外源有利基

因,因此,建立高效、稳定的组织培养转化体系是遗传

转化的首要环节和重要基础[1,4~6]。一般随继代培养时

间的延长,植物愈伤组织再生植株变得困难且变异比例

提高。建立快速、高效的愈伤组织诱导方法,可以随时

提供大量优质的试验材料,以便进行植物转基因、原生

质体培养和诱变等试验。

毛建军等[7]研究比较了N6、MS和NB培养基在日本晴成熟胚组织培养中的效果,结果表明,3种培养基

中,NB培养基对愈伤组织的诱导效果最好,转化效率

最高,获得了转基因水稻植株。针对以往利用水稻成熟

胚为外植体诱导愈伤组织时,均采用直接接种消毒的种

子或接种剥离的完整胚,诱导愈伤组织[1~3,5,7~16],本研

究增设2个切胚处理的接种方式,对3个水稻基因型进

行愈伤组织诱导和植株再生试验,通过分析比较不同成

熟胚接种方式的愈伤组织诱导率和愈伤组织质量,旨为

了解水稻成熟胚离体培养的表现特点与规律,以寻找高

效诱导胚性愈伤组织的方法,为方便、快捷、大量建立

水稻体细胞无性系奠定基础。

1󰀁材料与方法

1󰀂1󰀁试验材料

供试材料为中花11号、中花15号和日本晴3个水

稻品种的成熟种子。

1󰀂2󰀁试验方法

1󰀂2󰀂1󰀁外植体消毒󰀁选择成熟、饱满、无病斑的水稻

种子,剥去颖壳。在超净工作台上用0󰀂1%的HgCl2溶

液表面消毒15min,无菌水漂洗5次。用镊子和解剖刀

取出种子或成熟胚,将其接种于诱导培养基上,每个三

角瓶接种10粒种子或成熟胚,重复3次。

1󰀂2󰀂2󰀁接种方式󰀁采用4种接种方式:(1)用解剖刀

在胚上纵切1刀,将种子接种在培养基上(处理󰀂);

(2)用解剖刀将成熟胚从种子上剥离,再用解剖刀切第5期吕孟雨等:水稻成熟胚不同接种方式对愈伤组织诱导的影响

1刀,接种在培养基上(处理 );(3)用解剖刀将成

熟胚从种子上剥离后,直接接种在培养基上(处理

!);(4)将种子直接接种在培养基上(处理∀)。各

接种方式在继代前均不进行去芽等处理。

1󰀂2󰀂3󰀁培养方法󰀁在24~26#下暗培养。诱导培养

7d后,统计愈伤组织和出芽情况,计算愈伤组织诱导

率和出芽率。培养14d后,观察愈伤组织和出芽情况及

愈伤组织质量。培养25d后,将大部分愈伤组织(不

进行选择)接种于分化培养基上,在24~26#、光照

培养条件(12h光/12h暗,1500~2000lx)下诱导苗

的分化。选择少量生长旺盛、分散、质地紧密、呈淡黄

色颗粒状的愈伤组织进行继代培养。

培养基成分分别为:

诱导愈伤培养基:NB+2 4󰀁D2mg/L+蔗糖30g/L

+植物凝胶2󰀂5g/L(pH值5󰀂8)。

愈伤组织继代培养基:N6+2 4󰀁D2mg/L+蔗糖

30g/L+植物凝胶2󰀂5g/L(pH值5󰀂8)。

植株分化培养基:MS+6󰀁BA2mg/L+KT0󰀂5mg/L

+蔗糖30g/L+植物凝胶2󰀂5g/L(pH值5󰀂8)。

出芽率、愈伤组织诱导率和分化率的计算公式分别为:

出芽率=产生芽数/接种的种子或胚数∃100%

愈伤组织诱导率=产生愈伤组织的胚数/接种的种

子或胚数∃100%

分化率=分化出苗的愈伤组织块数/分化的愈伤组

织块数∃100%

2󰀁结果与分析

2󰀂1󰀁成熟胚不同接种方式的愈伤组织诱导率

诱导培养7d后,同一水稻品种不同接种方式的成

熟胚愈伤组织诱导率存在差异(表1)。除处理!外,

其他3种接种方式的愈伤组织诱导率和出芽率在不同品

种间的表现趋势基本一致,处理󰀂的愈伤组织诱导率最

高,出芽率最低;处理∀的愈伤组织诱导率最低(均为

0%),出芽率最高(%95%),说明处理󰀂是利用水稻

表1󰀁诱导培养7d后不同接种方式的愈伤组织诱导效果Table1󰀁Thecalluswithfourinoculationmethodsindicatedfor7days󰀁󰀁󰀁󰀁(%)

品种处理愈伤组织诱导率出芽率

中花11号󰀂65󰀂030󰀂0 35󰀂040󰀂0!5󰀂095󰀂0∀0󰀂0100󰀂

0

中花15号󰀂70󰀂025󰀂0 35󰀂065󰀂0!50󰀂030󰀂0∀0󰀂095󰀂0

日本晴󰀁󰀂75󰀂025󰀂0 40󰀂060󰀂0!20󰀂070󰀂0∀0󰀂0100󰀂0成熟胚诱导愈伤组织较好的接种方式。处理!各品种间

的愈伤组织诱导率和出芽率差异明显,且愈伤组织诱导

率高的品种,其出芽率低;愈伤组织诱导率低的品种,

其出芽率高的规律,这可能与品种自身的特性有关。

培养14d时,3个品种的愈伤组织诱导结果显示,

日本晴最容易诱导出愈伤组织,中花11号次之,中花

15号最难;愈伤组织质量也是日本晴最好,中花11号

次之,中花15号最差,表明不同水稻基因型的愈伤组

织诱导难易和质量存在着差异。3个品种处理󰀂的愈伤

组织诱导率差别进一步缩小,说明处理󰀂是1种对多种

水稻基因型通用的、适宜诱导愈伤组织的接种方式。培

养20d时,3个品种处理󰀂的愈伤组织诱导率均达到

100%。

2󰀂2󰀁成熟胚不同接种方式的愈伤组织状态

诱导7d的愈伤组织鲜嫩,白色,水分含量高(图

1);诱导14d,后出芽的基部也开始出现愈伤组织;随

时间的延长,不同处理的愈伤组织诱导率均达到

100%,表现出较高的愈伤组织诱导率,愈伤组织颜色

由白色逐渐变为淡黄色,但形态上有所差异。处理󰀂、

处理 和处理!的愈伤形态基本一致,呈颗粒状,浅黄

色,结构致密;处理∀的愈伤组织呈黄色,块大,干

硬,大部分有根毛分化(图2)。从出芽基部产生的愈

伤组织白色,干硬,结构较致密,颗粒较大,这类愈伤

组织容易分化生根,不利于植株再生,因此以调查诱导

7d时的愈伤组织诱导情况,来判断各处理间的差异更为客观、有效。

图1󰀁接种7d后的愈伤组织诱导和出芽情况Fig󰀂1󰀁Thecallusinductionandbuddingindicatedfor7days

图2󰀁接种25d后的愈伤组织诱导和出芽情况Fig󰀂2󰀁Thecallusinductionandbuddingindicatedfor25days

2󰀂3󰀁不同诱导方式对植株再生的影响

2󰀂3󰀂1󰀁不同诱导方式分化再生植株的速度󰀁从分化再

生植株的速度看,处理󰀂和处理∀分化出苗较快,中花&35&