第３Ｏ卷第８期 ２０１０年８月 中南林业科技大学学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖ０１．３Ｏ
Ａｕｇ． Ｎｏ．８
２０ｌ０
梨Ｓ ２一ＲＮａ ｓｅ基因启动子植物表达载体的 构建及转基因研究
刘学英 ，乌云塔娜 （中南林业科技大学ａ．经济林育种与栽培国家林业局重点实验室；ｂ．林学院，湖南长沙４１００Ｏ４）
摘要： 为了检测ｓ ２－ＲＮａｓｅ启动子的表达特性，以ｐＢＩ１０１．２为基础，构建了砂梨Ｓ ｚ—ＲＮａｓｅ基因启动子５’端 系列缺失植物表达载体ＰＳ１２一（Ｏ～５）一ＧＵＳ－ｐＢｌｌ０１．２，并通过农杆菌介导的Ｆｌｏｒａｌ Ｄｉｐ法转化哥伦比亚野生型拟 南芥。卡那霉素和ＰＣＲ鉴定表明：ＧＵＳ基因已整合到转基因植株的基因组中，为下一步进行启动子功能的鉴定 奠定了基础。 关键词：生物科学与技术；梨属；中国梨；梨Ｓ 。－ＲＮａｓｅ基因；启动子；植物表达载体；转基因研究 中图分类号： Ｑ７８６；￥６６１．１ 文献标志码： Ａ 文章编号： １６７３—９２３Ｘ（２０１０）０８－－００１１－－０７
Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ￥１ ２－ＲＮａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｐｅａｒ （Ｐｙｒｕｓ ｐｙｒｉｆｏｌｉａ）ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ
ＬＩＵ Ｘｕｅ－ｙｉｎｇ￣，ＷＵＹＵＮ Ｔａ—ｎａａ＇ （ａ．Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ｎｏｎ－ｗｏｏｄ Ｆｏｒｅｓｔ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ； ｂ．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０００４，Ｈｕｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｅｘａｍｉｎｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔｙｌｅ ｏｆ Ｓ１２ ＲＮａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ，ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ａｎｄ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ５’一ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ—ＧＵＳ ｆｕｓｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ａｎｄ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎｔｏ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ ＧＶ３１０１ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｗｅｒｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎｔｏ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｐｌａｎｔｓ（ｅｃｏｔｙｐｅ Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｏ）ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｆｌｏｒａｌ Ｄｉｐ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．Ａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ０．５×ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ５０ ｐｔｇ／ｍＬ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ ａｎｄ ＰＣＲ．ａｎｄ ｉｔ ｉｓ ｆｏｕｎｄｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＧＵＳ ｇｅｎｅ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ，ａｎｄ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｈａｓ ｌａｉｄ ａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｐｙｒｕｓ；Ｐｙｒｕｓ ｐｙｒｉｆｏｌｉａ；Ｓ１２－ＲＮａｓｅ；ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ；ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｓｔｕｄｙ
我国是梨属植物种质资源起源中心之一，境内 蕴藏有丰富的梨属植物资源Ⅲ。梨Ｓ－ＲＮａｓｅ基因 包含Ｓ－ＲＮａｓｅ基因和Ｆ－ｂｏｘ基因，其中Ｓ－ＲＮａｓｅ 基因在雌蕊中特异表达，控制雌蕊自交不亲和性状，
由此推测梨＆ＲＮａｓｅ启动子是雌蕊特异表达启动 子；因此克隆和研究梨Ｓ－ＲＮａｓｅ基因雌蕊特异表达 启动子并构建植物表达载体，进行转基因研究具有 非常重大的意义。雌蕊特异表达启动子启动某些外
收稿日期：２０１０ ０５—０８ 基金项目：湖南省科技计划项目及湖南省教育厅科学研究项目 作者简介：刘学英（１９８１一），女，硕士研究生，主要从事果树分子遗传育种研究；Ｅ—ｍａｉｌ：ｄｕｏｄｕｏ１９７９－－１９８１＠１６３．ｃｏｍ 通讯作者：乌云塔娜（１９７５－－），女，副教授，博士，硕士研究生导师，主要从事经济林育种与栽培的研究；Ｅ ｍａｉｌ：ｔａｎａｔａｎａ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ １２ 刘学英，等：梨￥１２一ＲＮａｓｅ基因启动子植物表达载体的构建及转基因研究 第８期 源毒素基因在雌蕊中特异高效表达，可以创造雌性 不育的园林绿化新品种，为园林绿化树木育种提供 新途径。
１材料和方法 １．１实验材料 研究用大肠杆菌ＤＨ５ａ为本室保存；２×Ｔａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、普通琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒均 购自北京天根生物有限公司，ｐＭＤ１８一Ｔ试剂盒购 自ＴａＫａＲａ（３ｖ连）生物技术公司；各种限制性内切 酶：Ｔ４ ＤＮＡ连接酶购自ｆｅｒｍｅｎｔｓ公司，ＬＢ培养 基、琼脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物和卡那霉素均购 自ＢＢＩ公司；０．５×ＭＳ培养基，乙醇，ＫＯＨ，Ｂｌｅａｃｈ 消毒液，蔗糖，Ｇａｍｂｏｒｇ Ｓ Ｖｉｔａｍｉｎｓ，表面活性剂 Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ厂７７，６－ＢＡＰ，卡那霉素，庆大霉素；其它生化 试剂和常规试剂均为超纯或分析纯。 植物材料为哥伦比亚野生型拟南芥。选取野 生型拟南芥种子，消毒春化后种植于花盆内，置于 ２２℃～２５℃光照下使其萌发生长，待植株生长到初 果期（即花絮基部的角果刚形成时），选取健壮植株 作为转基因材料。 １．２实验方法 １．２．１梨５１ －／￣ａｓｅ基因启动子的ＴＡＩＩ 一ＰＣＲ克隆 梨Ｓ －ＲＮａｓｅ基因启动子的ＴＡＩＬ－ＰＣＲ克隆 参见中国梨Ｓ－ＲＮａｓｅ基因启动子的ＴＡＩＬ－ＰＣＲ克 隆及功能预测＿２］。 １．２．２砂梨Ｓ 一ＲＮａｓｅ基因启动子５’端系列缺失 植物表达载体的构建 １．２．２．１系列缺失引物的设计 根据砂梨Ｓ 一ＲＮａｓｅ基因５’端启动子序列的 测序及元件预测结果，利用Ｐｒｉｍｅｒ ５．０软件设计 ＰＣＲ引物，各引物序列见表１。引物上酶切位点的 设计原则是：砂梨Ｓ 。－ＲＮａｓｅ基因启动子序列中没 有的酶切位点并便于与植物表达载体ｐＢＩ１０１．２的 连接。在正向引物的５’端设计了Ｓａｌ Ｉ酶切位点， 反向引物的５’端设计了Ｘｂａ Ｉ酶切位点。引物设 计片段特征见图１。
表１砂梨Ｓ ｚ－ＲＮａｓｅ基因启动子缺失ＰＣＲ引物 Ｔａｂｌｅ １ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ ｐｅａｒ￥１ ｚ－ＲＮａｓｅ ｇｅｎｅ
１．２．２．２植物表达载体￥１２一ｐｒｏ－（０～５）－ＧＵＳ－ ｐＢｌｌ０１．２的构建 砂梨Ｓ －ＲＮａｓｅ基因启动子缺失片段经ＰＣＲ 扩增，ＰＣＲ产物的回收、连接克隆、鉴定后，进行重 组质粒的提取；重组质粒和植物表达载体ｐＢｌｌ０１．２ 经ＳａｌＩ／ＸｂａＩ双酶切，分别回收Ｓ１２－ＲＮａｓｅ基因启 动子缺失片段与植物表达载体ｐＢｌｌ０１．２大片段，经 Ｔ４ ＤＮＡ连接酶连接后转化ＤＨ５ａ并阳性克隆鉴 定后，送到金思特科技南京有限公司测序。 １．２．３农杆菌介导的转基因研究 １．２．３．１拟南芥植株的转化 利用电击法将植物表达载体￥１２一ｐｒｏ＇（０～５）一 ＧＵＳ－ｐＢｌｌ０１．２转入到ＧＶ３１０１农杆菌中，参照 Ｃｌｏｕｇｈ的Ｆｌｏｒａｌ Ｄｉｐ法ｌ３］将带有重组质粒￥１２－ ｐｒｏ（０－－５）一ＧＵＳ－ｐＢｌｌ０１．２的农杆菌转化哥伦比亚 野生型拟南芥。 １．２．３．２拟南芥转基因植株的筛选 卡那霉素筛选参考拟南芥实验手册［＝４ ；并提取 Ｔ１代卡那霉素抗性植物ＤＮＡ，按文献［５］的方法， 用位于ｐＢＩ１０１．２载体多克隆位点两侧的ＣＦ１（５一 ＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ一３）和ＣＲｌ（５一 ＧＧＡＣＧＴＡＡＣＡＴＡＡＧＧＧＡＣＴＧＡ（、＿３）为引物 ＰＣＲ方法检测阳性转基因拟南芥植株。 第３Ｏ卷 中南林业科技大学学报 １３ 而 缸。 ｌ ＰｐＳ１＿＋２Ｆｒｏ－￣ 一 印豇 ５ 印ｓ｜，枷６－．ＲＹ Ｏ ｊ Ｇ．ｍ。 Ｉ皂Ｊ姬答元件糨关顺式作用元件 Ｂ。ｘ４．光反应相关元件 ｓｐｌ・光应答作用 ◇Ｇ土相 ｆ，光应答元件的一部分 巨羽０２－ｓｉｔｅ．玉米蛋白新陈代谢调节顺式作用元件▲１．ｂ ．光应答元件的一部分●Ｇ＾ｅ－ｍ０ｆｉｆ￣光应答元件＿戚 Ｉ了ｃ＾ 蜘锄 ，水杨酸应笞相关作用元件Ｉ］ ｉｅＩ＾应昝竞件 ●Ｐ ．赤霉索应蓍元件■ｍ Ｈ．１ｉｋＥ序列 ＿∞ ，光应答相关Ｊ瞬式作用元件 ＿Ｂ ｗ１．寞茁诱导作用晃件口Ｃ￣Ｎ４－Ｘ【ｏ ， ■Ｔｎ＾ ■转景起始位．占“Ｔ 雌麓特异衷达元件一起蛄窨碣子ｍ
．￣，．￣１２ｐｒｏ－Ｓ ｐｐｓｌ －４４ Ｐｐｓｌ却¨３ ｓｉ３Ｐ ｏ ｌ￣Ｓｌ２ｐ．ｒｏ－１ Ｐｐ￥］２ｐｅｏ－Ｏ 图１砂梨Ｓ ｚ－ＲＮａｓｅ基因启动子顺式调控元件以及５’端缺失片段设计 Ｆｉｇ．１ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ￥１２－ＲＮａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ ５’一ｆｌａｎｋｉｎｇ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒｓ ｌｏｃａｔｉｏｎ 图１中的数字标明了各顺式调控元件在砂梨ｓｌ２－ＲＮａｓｅ基因启动子序列中的具体位置；正向箭头、反向箭头代表缺失引 物的位置及方向，并在其下表明引物名称。
２结果与分析 ２．１砂梨Ｓ －ＲＮａｓｅ基因启动子５’系列缺失片段 表达载体的构建
植物表达载体均为ｐＢＩ１０１．２是植物基因工程 中常用的载体（见图２一Ａ），带有在细菌及植物中均 可表达的卡那霉素抗性基因以及ＧＵＳ报告基因， 且在多克隆位点前不含启动子序列，可以作为载体 用于分析启动子。￥１２一ｐｒｏ缺失片段阳性重组质粒 Ｓ１２一ｐｒｏ－Ｏ～Ｓ１２一ｐｒｏ－５与ｐＢＩ １０１．２经过Ｓａｌ Ｉ和 Ｘｂａ Ｉ双酶切（见图３）后，在Ｔ４ ＤＮＡ连接酶作用 下进行连接，对转化子进行ＰＣＲ检测，电泳结果见 图４。其中３，６号菌液扩增出与目的片段大小相一 致的特异条带，证明Ｓ１２一ｐｒｏ已经成功连接到 ｐＢＩ１０１．２中，构建成新植物表达载体Ｓ１２一ｐｒｏ一（０～ ５）一ＧＵＳ＿ｐＢｌｌ０１．２，见图２一Ｂ。这些片段均与预期 的条带大小相同，并对测序的Ｓ１２一ｐｒｏ－０—１０、Ｓ１２一 ｐｒｏ一１—４、Ｓ１２一ｐｒｏ一２—２、Ｓ１２一ｐｒｏ一３—１、Ｓ１２一ｐｒｏ一４—１及 Ｓ１２一ｐｒｏ－５—３测序结果比对，结果证明了Ｓ１２～ｐｒｏ一