·1· 小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养 一、实验材料 1. 主要仪器设备 (1) 倒置显微镜（Olympus，Japan） (2) CO2培养箱（BB16HF，上海力申科学仪器有限公司） (3) 100ml的玻璃培养瓶（江苏海门市大路塑料实验仪器厂） (4) 6孔培养板（COSTAR，每孔直径为3.5cm） (5) Eppendroff管 (6) 1ml,2ml,5ml的玻璃滴管各30支；10ml尖底离心管和直径为8cm的平皿 (7) 离心机 (8) 5ml冻存管 (9) 两套小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊） 2. 主要试剂配制 (1) MEF(mouse embryo fibroblast，小鼠胚胎成纤维细胞)培养液 ——低糖DMEM母液 1) 用一个1000ml的大烧杯加入1000ml无菌无内毒素的超纯水（购自福州新北生化工业有限公司）； 2) 将一小袋低糖DMEM(GIBCO/BRL,Cat.No.31600-034)全部加入上述水中，同时轻轻搅拌，并冲洗包装袋的内面以洗下所有的粉未。 3) 每升培养基中添加3.7gNaHCO3。 4) 搅拌直至完全溶解。 5) 用1NHCl或1NNaOH调培养基的pH至比最终的工作液的PH低0.2-0.3，调好PH后，将容器密封（在该实验中用1NHCl调PH至7.3）。 6) 立即用0.22um的滤器过滤除菌，装入高压过的盐水瓶中, 4℃保存(1个月内用完)。 ——MEF培养液 取100ml上述配好的低糖DMEM液体，加入10000IU青霉素钠（6.25mg）和10mg链霉素，溶解后再次调节PH至7.3，经0.22um的滤器过滤至高压过的血清瓶中，再添加10ml分装好的新生牛血清（Newborn Calf Serum, GIBCO/BRL,需56℃，30min灭活过），4℃保存至使用。 (2) PBS 在500ml超纯水中依次溶入 NaCl 4.0g KCl 0.1g Na2HPO4.12HO2 1.445g KH2PO4 0.1g 于121℃高压灭菌30min或经0.22um的滤器过滤除菌再分装入100ml洁净灭菌的盐水瓶中，再放入4℃冰箱中保存备用。 (3) 0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合消化液 在100ml超纯水中分别溶解 胰蛋白酶干粉(Trypsin, Sigma,T4799) 0.25g EDTA 0.02g ·2·
NaCl 0.7g Na2HPO4.12HO2 0.024g KH2PO4 0.024g KCl 0.037g Tris 0.3g D-葡萄糖 0.1g 酚红 1mg 于4℃过夜，使之充分溶解，用1mol/lHCl调PH至7.6, 0.22um的滤器过滤除菌，在–10～30℃下冻存备用。 (4) 0.1%的明胶水溶液 称明胶0.1g （Sigma, G—9391）溶于100ml超纯水中，先加热溶解，再分装入20ml的血清瓶中于121℃高压灭菌45min，于4℃保存。 (5) 10ug/ml的丝裂霉素C工作液 1) 0.5mg/ml的丝裂霉素C母液 在盛有2mg丝裂霉素C的小瓶中加入4ml高压灭菌的PBS，用高压灭菌的尖嘴混匀。即得0.5mg/ml的丝裂霉素C母液。 注：此步应在胶卷暗盒内操作，然后于4℃避光保存。 2) 10ug/ml的丝裂霉素C工作液 在24.5ml的MEF培养液中加入0.5ml的0.5mg/ml的丝裂霉素C母液，并经0.22um的滤器过滤至25ml血清瓶中。用前临时配制，并在37℃的CO2培养箱中预温30min.。 (6) 冻存液 取2支1.5ml Eppendroff管，每管均加入0.9ml DMEM（低糖型）培养液和0.1ml二甲基亚砜（DMSO，AR纯，中国医药集团上海化学试剂公司），置40C冰箱中预冷60min。 3. 动物： 性成熟期即大于8周龄昆明种小白鼠，领自福建医科大学实验动物中心。
二、实验步骤 1. 获取小鼠胚胎 (1) 将8周龄的昆白♀鼠和12周龄的昆白♂按1:1比例合笼。 (2) 次日晨10:00前观察♀鼠阴道口，有乳白色或蛋黄色胶冻状物（阴道栓）即定为怀孕0.5天。 (3) 实验时断颈处死孕13.5天的母鼠，置于蜡盘上。 (4) 75％酒精消毒后，用普通剪刀和镊子剪开下腹皮肤，并用两把弯头止血钳夹住切口处的皮肤向头尾两侧牵拉即剥皮。 (5) 用眼科弯镊和眼科弯剪打开腹腔，暴露出子宫。 (6) 用眼科弯镊夹住一侧子宫，分离子宫系膜，眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈，将整个子宫分离下来（注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染）。 (7) 将子宫置于无菌滤纸上去除血迹。 (8) 在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的平皿中，洗涤数次。 (9) 将子宫移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科弯剪沿子宫系膜打开子宫，取出带有胎膜的胎鼠，并用两把眼科镊子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。 (10) 将胎鼠移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头、四肢和内脏，得鼠胚躯干。 (11) 将鼠胚躯干移至另一盛有PBS的平皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血色。 ·3·
2. 小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养（组织块培养法） (1) 将干净的鼠胚躯干移至青霉素小瓶内（每6个鼠胚躯干装1瓶），用眼科直剪充分剪碎，剪成约1mm3以下的碎块（需剪约200下）。 (2) 用5ml的刻度吸管每瓶加入约3ml的PBS，混匀后连同鼠胚碎块一起移至一尖底离心管中。 (3) 室温下静置5min，用刻度吸管吸去上清液，留下鼠胚组织碎块。 (4) 向装有鼠胚碎块的离心管内加入1ml0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合消化液，轻轻吹吸30秒（可见组织块变得较为粘稠）。 (5) 再加入1 mlMEF培养液终止消化，室温下静置5min。 (6) 吸去上清液，留下鼠胚组织碎块沉淀。 (7) 每个离心管内加入5mlMEF培养液悬浮鼠胚组织块，并接种到100ml的螺口的培养瓶中（接种时应用滴管将组织块混匀）。 (8) 做好标记（如培养日期，细胞名称，编号），将装有鼠胚组织碎块的培养瓶放入37℃，5％CO2，100％RH的培养箱中培养。 (9) 培养的头两天不要晃动培养瓶，第三天可以观察，可见组织碎块附着于培养瓶底，周围细胞呈放射状生长，此时有多种细胞类型，有的是呈梭形的成纤维细胞，有的是呈圆形的上皮细胞。如果细胞已全部长满则可消化传代，如果未全部长满则可3/4换液或全量换液。 3. 小鼠胚胎成纤维细胞的传代培养： (1) 用滴管吸弃培养瓶中的培养液和未贴壁生长的组织块。 (2) 每瓶用滴管加入约3ml的PBS，轻轻前后晃动培养瓶，洗涤细胞一遍，吸弃PBS。 (3) 每瓶用滴管加入约2ml的0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合消化液，能盖住培养瓶底，室温下静置作用30秒，吸弃消化液。 (4) 在倒置镜下观察，当细胞变圆时即可加入4—5mll MEF培养液终止消化，并用滴管吸培养液用力吹打整个瓶底（约30下）。 (5) 将培养物全部吸置尖底离心管内，静置5min，将上层细胞悬液吸置另一离心管内。 (6) 1000r/min（80-1离心机为80g）离心5min，吸弃上清液。 (7) 每瓶加入3mlMEF培养液悬浮细胞沉淀块，并分装至3个100ml的培养瓶中。 (8) 每个培养瓶再补加4ml的MEF培养液，并吹打混匀细胞（吹打时勿产生气泡）。 (9) 将刚消化传代的细胞在倒置镜下观察，可见细胞呈大小不一的圆形。 (10) 将装有消化后细胞的培养瓶放入37℃，5％CO2，100％RH的培养箱中培养。 (11) 约2天后，细胞可贴壁长满，继续按1:3消化传代（操作同前，省略步骤5中的静置和换管）。 4. 饲养层制备 (1) 明胶预包被培养板：取1个6孔培养板（COSTAR ,每孔直径为3.5cm），先紫外照射30min，每孔用5ml刻度滴管加入3ml的 0.1%明胶水溶液，使其能覆盖孔的底部，室温下静置2h以上，用前吸弃明胶水溶液，并用2ml的PBS洗涤一遍。 (2) 丝裂霉素C作用2小时：将3瓶细胞生长连成一片的第3代MEF的培养液吸弃，每瓶加入3ml10ug/ml的丝裂霉素C工作液，再放入37℃、5%CO2、RH100%的培养箱中培养2h。 (3) 2小时后，吸弃培养瓶中的丝裂霉素C工作液，用预温的PBS洗涤细胞5次，每次3ml（加样时滴管靠在培养瓶的上壁或侧壁，勿直接冲冲击底壁的细胞）。 (4) 消化：每瓶中加入2ml0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA消化液，室温下作用10秒，立即吸弃消化液，加入3mlMEF培养液终止消化，并吹打壁底细胞（应注意逐瓶操作，避免消化时间过长而使细胞丢失过多）。 (5) 离心：将所有细胞悬液分吸至2个10ml尖底离心管内，1000r/min离 心5min，弃上清，得细·4·
胞沉淀块，往一个离心管的沉淀块内加入3ml的MEF培养液混悬细胞，再吸至另一离心管中混悬沉淀块。 (6) 计数并调整密度：吸出混悬后的细胞悬液50ul用血细胞计数板计数混合后细胞悬液的密度，然后将细胞悬液吸至一培养瓶或血清瓶中，补加适量的MEF培养液调整细胞密度为3×105个/ml。 (7) 接种：每孔加3 ml密度为3×105个/ml的细胞悬液（因为培养孔的直径为3.5cm，故其底面积S=πr2=3.14×1.752=9.42 cm2，根据接种的细胞数为1×105个/cm2,所以每孔可加3 ml密度为3×105
个/ml的细胞悬液）。 (8) 培养：将接种好经丝裂霉素C作用过MEF的6孔板放入37℃、5%CO2、RH（相对湿度）100%的培养箱中培养。 5. 饲养层细胞的冻存和复苏实验 (1) 冻存 1) 细胞：镜检，将处于对数生长期的小鼠胚胎成纤维细胞用于冻存实验。弃旧培养液，后以PBS或新鲜培养液漂洗细胞一次。 2) 消化：常规0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA消化制备单细胞悬液。 3) 离心重悬：80g离心10min，弃上清，以冻存液悬浮细胞，分装到冻存管中。 4) 冻存：细胞逐级降温冷冻：40C冰箱40min-200C冰箱40min-800C冰箱保存备用。 (2) 复苏培养 1) 冻融：从低温冰箱中取出冻存细胞，置于370C水浴锅内，不时振摇冻存管，使细胞快速融化。 2) 洗涤：转移冻存管内细胞于离心管中，80g离心5min，弃上清，沉淀用含新鲜DMEM（低糖型）重新悬浮，制备单细胞悬液。 3) 接种：接种细胞于培养瓶中，置370C、CO2培养箱内进行过夜培养，12～24小时后，更换培养基，按照细胞的生长状况进行相应处理。