脂肪干细胞原代培养流程
1.将收集到的脂肪组织移入50ml离心管,加入2倍体积的常温PBS用移液管吹打清洗:
清洗完成的指标?
2.1000转/分离心5分钟,是否需要低温?
3.用移液管将下层的液体和沉淀的血污弃掉,保留上层黄色组织,如何操作,为何不吸取
上层黄色组织?
4.吸取2倍体积的常温PBS用移液管吹打清洗
5.1000转/分离心5分钟
6.用移液管将下层的液体和沉淀的血污弃掉,保留上层黄色组织
7.吸取2倍体积的常温PBS用移液管吹打清洗
8.……反复重复以上操作3-4次,直至下层液体呈不浑浊,底部无血污(还是弃掉?),
保留上层组织
9.将组织用移液管移入无菌培养皿中,用剪刀将大块组织剪碎,将组织用吸管移入50ml
离心,加入与组织等体积的胶原酶(625U/ml)混匀后放入37℃孵箱,消化2h。
10.消化完将最上层颜色较深的油脂弃掉,注意保留组织,取与消化液等量终止液
(DMEM+10%NBS)终止消化,用弯头吸管吹打混匀数次,过100目筛网,收集滤液于离心管,1000转/分钟,离心5分钟。
11.弃上清,用培养液(α-MEM+10%NBS)重悬,根据沉淀多少接入培养瓶中(个人估计约
3E6/瓶),每瓶总液量8ml。
12.放入孵箱,24h天镜检,72或96h换液,之后隔天换液,培养12-14d传代。