第30卷 第6期 广东海洋大学学报 V ol.30 No.62010年12月 Journal of Guangdong Ocean University Dec. 2010收稿日期：2010-06-13基金项目：国家自然科学基金“红笛鲷仔鱼抗菌免疫基因的克隆及表达时序研究”（40906073）第一作者：魏世娜（1985－），女，硕士研究生，主要从事水产动物病害防治。
Email : weishinazi@ 通讯作者：简纪常，教授，主要从事水产动物免疫学及病害控制。
Email : jianjc@红笛鲷NCCRP-1基因原核表达条件的优化及纯化魏世娜，王 蓓，鲁义善，吴灶和，简纪常（广东海洋大学水产学院，广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨广东省高等学校水产经济动物病害控制重点实验室,广东 湛江 524025）摘 要：通过克隆编码红笛鲷（Lutjanus sanguineus ）非特异性毒性细胞受体蛋白-1（nonspecific cytotoxic cell receptor protein-1, NCCRP-1）成熟肽基因序列，然后与载体连接构建pET21a-NCCRP 融合蛋白表达载体，将其转入大肠杆菌BL21进行诱导表达并优化条件。
SDS-PAGE 分析表明，在异丙基-β-D -硫代半乳糖苷（IPTG ）浓度0.8 mmol/L 、37 ℃条件下培养3 h 后表达量最大，分子大小与预期值相符，融合蛋白主要以包涵体形式高效表达，通过HisTrap HP 柱子使其得到进一步纯化；Western blot 分析表明，该融合蛋白可与鼠抗His-tag 单克隆抗体发生特异性结合，说明获得该表达产物。
关键词：红笛鲷；NCCRP -1基因；原核表达；条件优化； 纯化中图分类号：S942.1 + Q344+.13 文献标志码：A 文章编号：1673-9159（2010）06-0025-06Purification and Optimization of Prokaryotic Expression of CrimsonSnapper (Lutjanus sanguineus ) NCCRP-1 GeneWEI Shi-na, WANG Bei, LU Yi-shan, WU Zao-he, JIAN Ji-chang(Fisheries College of Guangdong Ocean University , Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals & Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutions ,Zhanjiang 524025, China )Abstract ：The cloned mature peptide of Lutjanus sanguineus NCCRP-1 was connected with the expression vector pET-21a to construct fusion protein pET21a-NCCRP. This recombinant was transformed into Es cherichia coli BL21 and mainly expressed in the form of inclusion body. The optimal condition for the expression of this protein was that the cells were induced at 37 ℃, in 0.8 mmol/L of IPTG for 3 hours. The molecular weight of the expressed product was identical to that of expected protein by SDS-PAGE analysis, then purified by HisTrap HP column. The result of Western blot show that the expressed product could be combined with mouse anti-His-tag Mab. The fusion protein which lays the basic could be obtained for the future research on function and applied in fish innate immunity. Key words: Lutjanus sanguineus ；NCCRP-1 gene; conditions optimization; purification红笛鲷（Lutjanus sanguineus ）又名红鱼，隶属鲈形目、笛鲷科、笛鲷属，是我国南方沿海的重要经济鱼类之一。
但是随着水产养殖集约化程度的不断提高，鱼类病害所带来的损失愈发严重，严重制约水产养殖业的健康发展，而传统的化学药物的使用会引起病原体抗药性增加和药物残留等问题，因广东海洋大学学报第30卷26此有必要提高其免疫防御能力，而鱼类在病原刺激、环境突变等不利条件下，非特异性免疫起着至关重要的作用。
非特异性细胞毒性细胞（nonspecific cytotoxic cell, NCC）在鱼类先天性免疫反应中的细胞毒性效应机制中起重要作用[1-3]。
鱼类NCC主要来源于血液和淋巴器官，通过其细胞表面受体蛋白NCCRP-1（nonspecific cytotoxic cell recepor protein-1）识别靶细胞[4]。
NCCRP-1是一种Ⅲ型跨膜糖蛋白，具有胞外抗原结合域、胞内N端转录激活域及C端多种激酶磷酸化位点的信号域，因此，NCCRP-1在鱼类先天性免疫中的NCC毒性激活方面气了重要的作用。
目前国外已经克隆到虹鳟(Onchorhynchus mykiss)、鲤鱼(Cyprinus carpio L.) 、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、大西洋鳕鱼（Gadus morhua L.）、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）、金头鲷（Sparus aurata L.）等鱼类的NCCRP-1基因[5-10]，而对其功能研究仅局限于斑点差尾鮰和罗非鱼，国内还未见有关鱼类NCCRP-1基因的克隆及其蛋白纯化方面的报道。
本实验将已克隆到的红笛鲷头肾组织NCCRP-1基因成熟肽的编码序列（GenBank 登录号：GU075705）插入表达载体pET21a，转入大肠杆菌BL21，构建并优化了原核高效表达条件，并对该基因所表达的蛋白进行纯化，为其在鱼类先天性免疫中的功能及其应用研究奠定基础。
1 材料与方法1.1材料1.1.1载体和菌株大肠杆菌DH5α、BL21、质粒pET21a以及红笛鲷NCCRP-1基因（经测序鉴定无误）均为本实验室保存。
1.1.2主要试剂限制性核酸内切酶NdeⅠ和XhoⅠ、T4 DNA连接酶、Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、氨苄青霉素、DNA Marker、低分子蛋白Marker及预染标准相对分子质量蛋白均为TaKaRa公司产品；鼠抗His-tag单抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG 及DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司、PVDF膜购自PALL公司；DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯；PCR引物均由上海生工生物技术有限公司合成。
1.1.3仪器主要仪器有台式高速低温离心机（Sigma）、全温振荡培养箱（HZQ-F160，哈尔滨东联电子技术开发有限公司）、恒温摇床（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、超声波细胞粉碎机（JY92-2D，宁波新芝生物科技股份有限公司）、凝胶图象分析仪（GDS-8000，美国Gene公司）、蛋白纯化柱HisTrap HP1mL预装柱（GE公司）、小垂直板电泳槽及Trans-Blot转印槽（美国Bio-Rad）等。
1.2方法1.2.1NCCRP-1基因的克隆及重组表达质粒pET21a-NCCRP的构建与鉴定根据已获得NCCRP-1基因cDNA序列设计一对特异性引物，上游引物ProS为：5'-CCAACATATGTCTGCAGC TGAGTGGAAGAAG-3'（CATATG为NdeⅠ酶切位点）；下游引物ProA为：5'-CCGCTCGAGGGAGCT GGTTTTGGTTGGCTTG-3'（CTCGAG为XhoⅠ酶切位点）。
以实验室已测序正确的克隆载体pMD18T-NCCRP为模板，用含有酶切位点的特异性引物Pros、ProA进行PCR扩增，反应条件为：94 ℃下预变性5 min；94 30 s℃，61 45 s℃，72℃60 s，共34个循环；再72 ℃下继续延伸10 min。
PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段。
PCR扩增产物和表达载体pET21a分别经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切并回收酶切产物，用T4连接酶16 ℃下连接4 h以上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，挑取阳性菌落抽提质粒，进一步通过酶切和菌落PCR鉴定选择阳性克隆测序。
1.2.2 不同诱导时间对目的蛋白在大肠杆菌中表达量的影响阳性克隆经测序鉴定正确后，提取pET21a-NCCRP质粒转化大肠杆菌BL21感受态；挑单克隆检测为阳性后，接种到2 mL含氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃下振荡培养（180 r/min）4 h以上，按1∶50的比例接种到新鲜的同种液体培养基中扩大培养至生长对数期（约4 h），取1 mL 菌液作未诱导对照，其他加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，于37 ℃继续振荡培养，分别于诱导1、2、3、4、5和6 h后各取1 mL菌液，以SDS-PAGE（浓缩胶浓度50 mg/mL，分离胶浓度12 mg/mL）分析目的蛋白表达量。
1.2.3不同浓度IPTG对目的蛋白在大肠杆菌中表达量的影响按1.2.2培养细菌，取1 mL菌液作未诱导对照，分别加入不同体积的IPTG，使其终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L，于37℃继续剧烈振荡4 h 后各取1 mL 菌液，以SDS-PAGE 分析目的蛋白的表达量。