摘要 盐酸克伦特罗酶联免疫反应适用于尿样、组织和饲料等样品中克伦特罗残留的量检测，是一项筛查盐酸克伦特罗残留的新技术。克伦特罗作为一种主要的 β- 兴奋剂应用于畜禽肉制品生产中, 用以提高肌肉和脂肪的比例并加快生长速度。由于克伦特罗可作为肌肉舒缓剂用于人类疾病治疗, 在畜禽中过量残留可能会对消费者造成危害, 为此, 被禁止在食品生产中应用。由于该检测方法技术性强，对试验环境要求特殊，因此影响ELISA检测质量的因素有很多，如试剂因素、标本因素和操作因素等。试剂的质量固然是影响检测结果准确性的关键因素,然而检测人员的操作是否规范合理对ELISA检测结果的影响也不可忽视。本论文就ELISA法检测猪的肝脏中盐酸克伦特罗含量以及试剂的选择、温育条件、洗涤次数、准确加样、显色时间等多个操作因素对检测结果产生的影响进行了分析并针对性的提出了相应的控制对策，从而为养殖者和政府监督管理部门提供了更准确快速的检测盐酸克伦特罗残留的方法。

关键词：酶联免疫；检测；盐酸克伦特罗；关键控制因素 摘要应该改为： 本论文就ELISA法检测猪的肝脏中盐酸克伦特罗含量以及试剂的选择、温育条件、洗涤次数、准确加样、显色时间等多个操作因素对检测结果产生的影响进行分析，针对性的提出了相应的控制对策，从而为养殖者和政府监督管理部门提供了更准确快速的检测盐酸克伦特罗残留的方法。试验结果表明，、、、、、、 Abstract Clenbuterol hydrochloride enzyme-linked immune response is applicable to urine, fodder and other groups and the amount of clenbuterol residues in the sample testing, clenbuterol hydrochloride residue is a screening of the new technology. Clenbuterol, as a main beta stimulants used in products production, to increase the proportion of muscle and fat and speed up the growth. Because of clenbuterol can be used as a muscle relieving agent in human disease treatment, in livestock and poultry excessive residues may cause harm to consumers, therefore, have been banned in food production in the application. Because the test method of technical and special requirement to the test environment, so that the influencing factors on the quality of the ELISA detection has a lot of, such as reagents, specimen and operating factors. Reagent is the quality of the key factors influencing the accuracy of the test results, however, check whether the operation of the personnel specification is reasonable on the result of ELISA detection also cannot be ignored. This thesis just ELISA method to detect clenbuterol hydrochloride content in pig's liver, as well as the choice of reagent, temperature condition, washing frequency, accurate sample and chromogenic time multiple operating factors on the impact of test results are analyzed and put forward the corresponding control countermeasures, which provides the farmers and the government supervision and regulation department more accurate rapid detection of clenbuterol hydrochloride residue method.

Key words: enzyme-linked immune；Detection；Clenbuterol hydrochloride； The key control factors 一、引言 1.1 文献综述 盐酸克伦特罗酶联免疫反应测试盒适用于尿样、组织和饲料等样品中克伦特罗残留的量检测。克伦特罗作为一种主要的 β- 兴奋剂应用于畜禽肉制品生产中, 用以提高肌肉和脂肪的比例并加快生长速度。由于克伦特罗可作为肌肉舒缓剂用于人类疾病治疗, 在畜禽中过量残留可能会对消费者造成危害, 为此, 被禁止在食品生产中应用。根据美国 FDA 和WHO 规定, 在肌肉和脂肪中克伦特罗的含量不能超过 0.2 ng/g, 在肝脏和肾脏中其含量不能超过 0.6 ng/g。与传统的 HPLC或 GC- MS 方法相比, 酶联免疫方法具有操作简便、灵敏度高、成本低的优点。盐酸克伦特罗酶朕免疫反应测试盒为养殖者和政府监督管理部门提供了更准确快速检测克伦特罗残留的方法, 该试剂盒的特点包括 4 方面, 第一, 该试剂盒的提取方法能达到 75 %～95 %以上的回收率, 可以不需用有机溶剂并在 10～30 min 之内完成提取过程。第二, 高灵敏度(0.05 ng/g); 低检测下限(肉类/ 脂肪 0.025 ng/g, 尿液 0.05 ng/ml, 饲料 0.2 μg/kg)。第三, 检测过程只需不到 2 h。第四, 高重复性。 食品安全问题是目前全球范围内的焦点和热点之一,猪肉中盐酸克伦特罗残留危害事件曾触目惊心[2]。筛查兽药盐酸克伦特罗残留,是畜禽产品质量安全检测时的必检项目。目前国内外用于检测动物性食品中盐酸克伦特罗的方法主要有色谱检测技术，但这类方法对检测设备、环境条件、操作技能要求高，检测周期长，价格昂贵，不方便普及。另一类检测方法是免疫分析技术，其中的酶联免疫吸附试验(ELISA)是快速筛查盐酸克伦特罗残留的标准方法之一[3]。但是该方法技术性强，操作过程复杂，对试验环境要求特殊，检验时稍有不慎，就会产生许多失误,导致误检或漏检[4]。为了提高工作效率,确保检测质量,根据盐酸克伦特罗的生物学特性,针对应用ELISA检测畜禽产品残留时易产生的失误,提出了相应的控制对策, 以减少检测工作的失误。本实验利用酶联免疫法检测猪肝中盐酸克伦特罗的残留量以及对影响本实验结果的关键控制因素进行了分析，从而为人类食用到安全放心肉提供了一个快速、高效的检测方法。 修改意见：请将第一段和第二段糅合在一起，显示出层次感和条理性。

1.1.1 基本生物学特性 1.1.1.1 理化性质 盐酸克伦特罗(Clenbuterol, CL) 是一种平喘药的商品名, 又称氨哮素、克喘素, 化学名称为羟甲叔丁肾上腺素, 或2- [(叔丁氨基)甲基]- 4- 氨基- 3, 5- 二氯苯甲醇盐酸盐， 药品名为双氯醇胺、舒喘宁、克喘素等［5］。中文名称有: 瘦肉精、克伦特罗、盐酸克伦特罗、盐酸双氯醇胺、克喘素、氨哮素、氨必妥、氨双氯喘通和氨双氯醇胺。英文名称有: Clenbuterol、Spiropent、Planipart、NAB365、4- Amino- 3, 5- dichloro- alpha- {[(1,1- dimethylethyl)amino]m ethyl} benzenemethanol。CAS号: 37148- 27- 9。分子式: C12- H18- Cl2- N2- O。 其理化特性为白色或类白色的结晶粉末, 无臭、味苦, 熔点 161℃, 溶于水、乙醇, 微溶于丙酮, 不溶于乙醚。盐酸克伦特罗为人工合成的β2受体激动剂［6］，其化学性质稳定，一般方法不能将其破坏，加热到 172 ℃ 才能分解［7］。CL 是儿茶酚胺化学合成的一种衍生物，属于苯乙胺类(PEAs)药物，在体内不会破坏分解，以原形排出体外［8］。CL 对支气管平滑肌受体有较好的选择性兴奋作用，缓解由于过敏性反应引起的支气管痉挛和黏膜充血、水肿而发挥平喘作用。CL 还有能量重新分配的作用，促进脂肪分解和蛋白质的合成，从而实现动物营养再分配，使得畜禽生长速度增快，瘦肉大大提高［9］，因此俗称为“瘦肉精”。在临床上以盐酸盐剂型曾用于治疗牲畜支气管哮喘、难产等病症。通常每日用药量小于1/kg,连续用药时间少于10d。当人体摄入剂量超过0.1ug/g残留的畜禽内脏组织时,便会出现一些明显的中毒症状,如肌肉震颤、行走不稳、手握无力、心动过速、心律失常、腹痛、恶心、眩晕等[2]。

1.1.1.2 盐酸克伦特罗毒理分析 盐酸克伦特罗毒理是, 克伦特罗能激动 β2- 受体, 对心脏有兴奋作用, 对支气管平滑肌有较强而持久的扩张作用, 口服后较易经胃肠道吸收。该药物可选择性地作用于肾上腺素受体, 是一种强效激动剂, 可引起交感神经兴奋, 在药物剂量下, 具有松弛气管平滑肌作用, 用于治疗支气管炎、肺气肿等引起的哮喘。20 世纪 80 年代初,美国一家公司意外地发现, 将一定量的盐酸克伦特罗药物添加在饲料中, 可明显促进动物生长, 并增加瘦肉率。随后, 这一新发现在一些国家被应用于养殖业。盐酸克伦特罗进入体内后具有分布快、消除慢的特点, 能够改变营养的代谢途径, 促进动物肌肉、特别是骨骼肌蛋白质的合成, 抑制脂肪的合成和积累, 从而使生长速度加快、瘦肉相对增加[17]。一般来说, 饲料中