第42卷第8期2015年8月Vol.42,No.8August,2015

中国激光

CHINESEJOURNALOFLASERS

0804003-光学相干层析成像技术用于三维生物打印水凝胶支架结构的定量评价研究

王玲涂沛石然徐铭恩杭州电子科技大学生命信息与仪器工程学院,浙江杭州310018摘要三维生物打印水凝胶支架内部结构的无损检测分析，对组织工程支架设计制造和生物功能实现具有重要意义。提出用扫频光学相干层析成像技术(SS-OCT)对三维生物打印的水凝胶支架进行无损成像和定量分析。设计和打印了4种代表性结构的三维水凝胶支架。用高分辨SS-OCT成像系统重建并揭示了支架内部三维结构，识别出打印支架与设计结构的差异以及孔融合、孔变形、通道堵塞等打印缺陷。基于阈值分割和形态操作的自动分析算法，定量表征了支架的孔隙大小及分布、实体支撑尺寸、孔隙率和三维连通性等结构参数。研究证明，OCT技术可以为三维生物打印水凝胶支架的优化设计、过程控制、功能分析提供有力工具。关键词生物光学;光学相干层析成像;三维生物打印;水凝胶支架;定量表征中图分类号TN247文献标识码Adoi:10.3788/CJL201542.0804003

QuantitativeEvaluationofThree-DimensionalBio-PrintedHydrogelScaffoldsbyOpticalCoherenceTomography

WangLingTuPeiShiRanXuMing′enCollegeofLifeInformationScienceandInstrumentEngineering,HangzhouDianziUniversity,Hangzhou,Zhejiang310018,China

AbstractNondestructiveinvestigationandanalysisoftheinternalstructureofthree-dimensional(3D)bio-printedhydrogelscaffoldsisveryimportantforthedesign,fabrication,andbiologicalfunctionsofengineeredtissuescaffolds.Swept-sourceopticalcoherencetomography(SS-OCT)isappliedtonondestructiveimagingandquantitativeanalysisof3Dbio-printedhydrogelscaffolds.3Dbio-printingtechniqueisusedtoproducefourrepresentativedesignedgeometriesofhydrogelscaffolds.High-resolutionSS-OCTvisualizesthethree-dimensionalinternalstructureofthescaffolds,identifiesthedifferencebetweenthedesignedmodelandas-producedconstruction,anddetectstheprinteddefectssuchasfusedpores,deformationofpores,breakagesofflowchannels.Theautomaticimaginganalysisalgorithmsaredevelopedtoquantitativelycharacterizetheporesize(PS)anditsdistribution,strutsize(StS),volumeporosity(VP),andporeinterconnectivity(PC).ItconcludesthatOCTmaybeakeytoolforthedesignoptimization,processrefinement,functionrealizationof3Dbio-printedhydrogelscaffolds.Keywordsbiotechnology;opticalcoherencetomography;three-dimensionalbio-printing;hydrogelscaffolds;quantitativecharacterizationOCIScodes170.3880;170.4500;170.3130

收稿日期:2015-02-28;收到修改稿日期:2015-04-18基金项目:国家自然科学基金(61108083,81371695)作者简介:王玲(1980—)，女，博士，副教授，主要从事生物医学光学成像方面的研究。E-mail:lingw@hdu.edu.cn

1引言设计和制造满足再生医学性能要求的支架一直是组织工程研究的重点。三维生物打印技术可以无毒且方便地按照预先设计的几何结构制备出完全连通的三维结构，已成为制造可以进行细胞接种或细胞封装

1中国激光0804003-的生物支架的良好工具[1]。水凝胶具有良好的生物相容性、可降解性、亲水性以及包裹细胞的强大能力，这使得水凝胶被广泛应用于构建组织工程支架[2-3]。水凝胶和三维生物打印技术的结合为开发可细胞接种/封

装的组织工程支架提供了一种设计关联的可控解决方案。但水凝胶成分复杂、力学性能差，要三维打印出与设计结构一致的支架尚有许多问题需要解决。支架的力学性能主要由支架的孔形、孔径、孔隙率及连通性等结构参数决定，支架的内部结构特征直接影响着细胞的增殖和分化功能[4]。因此，无损深入支架内部进

行高分辨成像对支架制造和功能分析具有重要意义。为避免破坏性的切片检查，多种成像技术被用来检测组织工程支架和组织[5-9]。如应用显微计算层析术

对骨组织工程支架成像[6]。磁共振成像(MRI)技术用于检测组织工程支架移植前的结构和成分，并监测间充

质干细胞分化形成组织[7]。超声弹性成像可用于描述大块工程组织内的弹性粒子分布[8]。但是，这些成像技

术用于水凝胶支架成像仍然存在问题。水凝胶的高含水量特点导致显微计算层析术对水凝胶成像时对比度过低，且X射线的高离子性可能损伤细胞。MRI和超声弹性成像的分辨率有限。此外，共焦显微术、多光子显微术(MPM)等光学成像方法也可用于对组织工程支架成像[9]，其分辨率高，可以达到亚微米级，缺点在于

成像深度有限，如共焦显微术对高散射样品的成像深度大约为100μm，MPM的穿透深度也限制在400~500μm。光学相干层析成像[10](OCT)是近年来迅速发展起来的实时无损微观成像技术，能够提供样品三维

高分辨图像，成像分辨率可以达到1~15μm，对高散射样品的成像深度达到数毫米。OCT优越的成像性能在无损检测领域及组织工程领域具有广泛应用前景[11-15]。

近年来，OCT应用于传统组织工程技术制造的支架和组织的研究正逐步开展[16-21]。Rey等[18]将细胞与凝

胶混合，用OCT技术检测了细胞在凝胶材料中的三维和四维迁移。Chen等[21]利用OCT对粒子盐析法制备的

水凝胶多孔结构进行定量评价。国内曾有报道OCT用于分辨率测试3D打印光敏树脂制作的模拟眼，研究重在OCT分辨率的标定价值[22]。这些研究验证了OCT用于水凝胶支架评价的可行性，但由于缺乏凝胶结构

的精确制造技术，对生物功能具有重要意义的支架结构的研究比较局限。三维生物打印技术可以预定义水凝胶支架孔的形状、尺寸和内部通道结构，为OCT在这一领域的应用提供了新空间，也为支架内部结构的定量评价带来新问题。因此，必须发展新算法来自动处理大量的OCT序列图像，定量可视化支架内部通道结构，对比设计模型和实际结构差异，表征支架的孔隙大小(PS)和分布、实体支撑尺寸(StS)、孔隙率(VP)和三维连通性(PC)等参数，以便提高三维生物打印支架的可控性和稳定性，更好地预测支架的生物学功能。本文基于之前开发的三维生物打印平台[3,23]，设计和制造了4种预先定义几何尺寸及结构的水凝胶支

架，利用扫频光学相干层析成像(SS-OCT)系统实现三维生物打印支架的高分辨成像和结构定量评价。基于图像阈值分割和形态操作开发了自动分析算法来实现支架复杂内部结构的三维可视化，定量表征三维生物打印水凝胶支架的结构参数，分别从二维和三维空间详细比较分析了设计模型和制备支架之间的差异性，初步探讨了打印工艺与支架成型结果之间的关联性。

2支架的设计与制备

采用Solidworks软件设计了4种不同的支架结构，按照孔形和内部流体通道的不同可以定义为T400、R400、T400-LC、R400-LC。其中T代表设计的支架大孔孔形为三角形，R代表设计的孔形为正方形。400代

表设计的PS为400μm，定义PS为与孔面积等大的圆的直径。支架的StS设定为200μm。LC代表支架存在横向通道(LC)，若没有横向通道，支架只有纵向通道，且纵向通道与孔形类似；若存在横向通道，对于T400-LC来说，横向通道定义为支架表面以下800μm处横向打通沿孔以及与孔成60°夹角的通道，对于R400-LC，

横向通道定义为支架表面以下800μm处横向打通沿孔和垂直孔方向的通道，所有横向通道为方形柱体，且方形的边长为400μm。支架的外形为圆柱体，圆柱直径为10mm，高为4mm。明胶和海藻酸钠[3]都是天然生物材料，无毒、可降解，与细胞生物相容性良好，采用明胶和海藻酸钠按照

1∶1比例均匀混合制成打印用的水凝胶生物墨水，按照上述设计的理论模型制备3D多孔水凝胶支架。支架

的制备基于之前开发的三维生物打印平台，如图1所示，该打印机有两个喷头，均采用精密气动喷头，一个喷头装有打印用的生物墨水，一个喷头装雾化交联用对细胞无害的CaCl2

溶液，三维生物打印机的中心控制系

统控制喷头的初始自动定位(IAL)、驱动的气动压力(P)、温度(T)及X/Y/Z三维运动(M)。打印时生物墨水喷射2