干细胞治疗肝病的研究现状
第三军医大学西南医院全军感染病研究所 !∀
刘涛张世昌王英杰
干细胞的可塑性为严重肝病的治疗带来了曙光。近年来,许多研究团队就能产生肝细胞的干细胞
来源、各种干细胞向功能性肝细胞的诱导分化策略以及其在肝病治疗的基础研究做了大量工作。
#肝内肝外的干细胞从肝脏的胚胎发育学和肝脏形成后的肝细胞再生来源的角度推测,可以产生肝细胞的来源主要有三个%胚胎干细胞&∋()∗+,−./0&∋&1/,23.4、残留在肝内的肝干细胞和其他组织器官的特异性干
细胞,后两者归属成体干细胞,这一推测正在不断地被实验证实。23.具有在体外无限增殖并保持其能分化成所有细胞类型的特性,理论上它可以向三个胚层的任何
细胞分化,其中也包含肝细胞。自鼠与人的23.被相继分离成功后,其多能分化潜能已在体内外诱导实
验中所证实,这不仅为胚胎发育研究提供良好的工具,也为干细胞为基础的治疗提供资源。目前,限制
23.研究应用的因素主要包括%伦理学问题、组织相容性以及移植后畸胎瘤的发生。全面有效地诱导分化和分选富集可减少或避免畸胎瘤的发生,经改进的体细胞核移植技术在灵长类23.的克隆成功应用有
望解决组织相容性问题,但无法回避伦理学问题。新近通过向小鼠及人体细胞稳定转染几个关键的转录
因子从而成功产生23.样细胞一诱导的多能干细胞−,56.&5716)−卯0&,0/0&∋.&,/,−834可能会同时解决伦
理学、组织相容性问题。这一新颖的发现提示无论是干细胞还是成熟的体细胞可能都具有高度的可塑性,通过一定的细胞外分子诱导或细胞内基因修饰,可以促使各类细胞顺向、逆向或横向分化,而且
这种分化可以跨越多个分化层次与途径,从而使干细胞的概念模糊化。
在肝脏发育成熟后,包含着三种不同的细胞参与肝细胞的再生。第一种是成熟的原代肝细胞,对
肝脏损伤反应迅速,具有单向分化潜能的干细胞样特性,但其并不是真正意义上的干细胞9第二种为卵圆细胞+:;1&1/,+./4,当广泛损伤发生时,这种定位于胆道系统的+./将被激活,有学者认为这是残留在肝内的肝干细胞,可分化为肝细胞和胆管上皮细胞,然而成人肝中卵圆细胞的存在与否和形态变化仍然有争论9第三种细胞是来源于肝外的干细胞,其可能来自于骨髓、脂肪、脐血、羊水等其它组织或器官,此类干细胞原本分化命运可能并不是肝细胞,许多研究展示了它们向肝细胞定向诱
导分化的潜能。并且这些来源的细胞相对于前两者而言,突破了伦理学的限制,具有取材方便、免疫
排斥低的特点,正受到许多研究者的青睐。而其中尤为引人注目的是脂肪组织,相对于其它组织,脂
肪组织的取材是无创的,不影响病人的健康,并且数量充足。<干细胞向肝细胞分化的策略不同类型的干细胞向肝细胞的定向分化策略都是基于目前对肝脏发育学的认识以及对啮鼠动物胚胎的研究,这些研究揭示了一些共性的可能线索。如从肝细胞的诱导发生到成熟的肝细胞生成,再到成体后肝细胞的修复再生,存在着大量而复杂的信号,它们直接或间接的调控着肝脏发育的转录调控
网络。细胞外刺激信号包括细胞因子、生长因子以及细胞外基质,通过相应的受体或通路调控着干细
胞内的基因转录水平,影响着干细胞的分化命运。因此也有学者直接通过高效表达与肝细胞定向分化
密切相关的转录因子,对干细胞进行基因修饰,从而促进肝细胞的定向分化。目前模拟体内发育环境
的连续信号刺激已经被演示出来。而干细胞的分化调节是如此复杂,各种诱导信号要在空间、时序、! =剂量等各个方面达到有效的组合,干细胞分化内部潜在的机制远未完全明了,这也导致了至今仍然没有统一而确定的分化策略出现。
23.向肝细胞定向分化的体外策略是采用优化组合拟胚体&∋0盯+−5(+5−&/,2>/4形成或直接诱导、
共培养、细胞外信号刺激或基因修饰、富选细胞等方法,最大限度的得到高纯度、足够量的功能性肝细胞。体内的诱导分化是将进行了一定的体外诱导刺激分化后的2/.直接移植入肝再生或肝损伤动物模型
中。高效诱导、功能性分化、分选富集、大量制备和功能维持是23.定向分化策略的中心。起初,许多学者将23.直接注入动物体内,期望通过肝脏内部提供的微环境直接促进肝细胞定向分化,但结果是产
生致命的畸胎瘤。此后,通过形成2>/后再进行定向诱导分化,利用2>/的三维结构特点,增强细胞相
互作用,促进肝细胞的形成。然而,复杂的三维结构特点同时也诱导了其它类型细胞的分化,这样也导致了即使进行了后续的定向分化、筛选工作,也难以避免移植后畸胎瘤的发生。共培养的方式能模拟发育进程中的细胞相互作用和影响。研究显示2/.或经过一定诱导分化的2/.
与肝脏非实质细胞、胎肝细胞或可能有用的其他细胞进行共培养,对于2/.的肝细胞分化具有重要的
意义。但目前共培养是如何影响分化进程和细胞表型的仍然是个迷,这些共培养中的细胞产生的未知
因子同样可能诱导其它类型细胞的分化,如何选择和分离这些辅助细胞也是一大难题。
不依赖于2>/形成的23.直接诱导分化似乎正展示着其优势,它不依赖于2>/形成和共培养,而是通过直接的连续诱导刺激策略。这些研究通过对23.一定形内胚层5&?−,−0−:&&,5+5&)∋4一肝细胞分化一成熟
肝细胞诱导策略的关键因子进行优化,模拟肝细胞发育线路,避免了2>/形成和共培养诱导分化中的
非目的分化。但与此同时,也削弱了必需的诱导信号组合,获得的肝细胞功能可能受到影响。
几乎所有出生后的器官和组织都含有干细胞,在成体中存在不同数量和分化潜能的干细胞谱,它
们能够在炎症、疾病和衰老过程中重生或被激活。存在于骨髓基质、羊水、胎盘、脂肪组织、脐带血
和许多胎儿组织或器官的间充质干细胞正吸引着再生医学研究者的目光,它们向肝细胞分化的潜能已经被许多独立的研究组证实。从肝脏发育进程上看,这些间充质干细胞可能是23.向成熟肝细胞发育
旅程中的中转站或中间状态。因此各类间充质干细胞与23.向肝细胞定向分化的策略有着很大的相似
之处,包括所采用的细胞因子、生长因子以及细胞外基质与共培养、体内诱导方式等。所不同的是,
其不需要2>/形成或定形内胚层诱导步骤,且其体内诱导实验中无致瘤性危险,然而分离与扩增间充
质干细胞相对困难成为限制其应用的主要因素。!干细胞在肝病治疗中的应用研究
肝细胞移植与生物人工肝在治疗急慢性肝病中正展示了其诱人的前景,而肝细胞来源的缺乏和体
内外肝细胞功能难以长期维持制约着其临床应用,具有无限增殖和自我更新特性的干细胞为解决这一
问题带来希望。然而,由于存在上述许多尚未解决的问题,目前有关干细胞治疗肝病的研究,大多仍
停留在动物实验水平。
现阶段受益于干细胞为基础的肝病治疗,首当其冲的应是肝脏基因表达或蛋白分泌异常的疾病,这
些疾病包括遗传疾病、代谢缺陷性疾病、凝血障碍疾病等。胎肝细胞和胎肝中存在的肝祖细胞相对于原
代肝细胞具有更强的体外和体内增殖活性,移植入受伤的肝脏中,对改善肝功能情况、减少动物死亡率
发挥着明显的优势,然而因为严重的伦理学问题,许多国家已经明文禁止该项实验的继续进行。
骨髓间充质干细胞包含着多潜能成体祖细胞和内皮干细胞,骨髓来源的细胞能否与如何在肝再生中发挥作用,至今没有定论。早期直接将未分选的骨髓注入动物的肝中可改善实验动物的存活率,但
存在着许多未知和危险的因素,且机制至今未完全明了。国外学者新近完成的关于骨髓来源的细胞应!# 用于慢性肝脏疾病的临床实验表明此种治疗方法的确能够改善部分病人的肝功能,但要确认这种疗效
需要更为精密和大量的数据支持。鉴于肝脏是胎儿期的造血源,造血干细胞可能在成人器官中也同样
具有生成肝实质细胞的能力,但有学者对以往关于造血干细胞在肝脏中产生肝细胞的能力进行了系统回顾,结论是在生理和病理的情况下,造血干细胞不能转分化为肝细胞,对肝细胞的形成无贡献,但
也有相反的结论。
最近的研究提示骨髓来源的间充质干细胞具有潜在的治疗肝纤维化进程的作用,并通过实验证明了其机制,即减少胶原的沉积和向肝细胞的分化。另外也有研究提示骨髓来源的间充质干细胞分泌的分子可能通过调节机体的免疫功能从而促进急性肝衰竭动物的恢复。而骨髓来源的细胞对肝细胞的形
成的作用是转分化、融合、基因转移,还是存在于骨髓里多潜能祖细胞的作用没有统一的意见。这些
没有定论的结果和理论带来了希望的同时,也提示了骨髓来源的细胞进入肝病临床应用还有漫长的路
要走。
来源于脂肪、脐带血、羊水等组织的间充质干细胞向肝细胞诱导分化的报道给肝脏疾病的干细胞
治疗带来新的细胞来源,取材方便以及可能的个性化治疗可能吸引更多的研究工作,但目前其仍然处
于探索阶段,尚缺乏治疗肝脏疾病的动物实验和临床实验报道。
未诱导分化完全的23.移植入肝脏容易导致畸胎瘤,而且目前尚缺乏统一而高效的23.向肝细胞
定向诱导分化手段,这些因素导致23.在肝脏疾病的应用研究受限。但最新的研究为这一领域带来一
丝曙光,有学者将23.经过一定诱导分化,再与肝非实质细胞进一步共培养,经过白蛋白启动子驱动荧光蛋白表达并进行富集,将种入该细胞的肝支持设备整体移植入受损的肝脏组织中,明显改善了肝
衰竭鼠的存活率。另有报道将能够在甲胎蛋白启动子作用下表达≅∗Α甩ΒΧ8的转基因2/.经过一定的诱
导,分化成表达甲胎蛋白的内胚叶细胞并移植入肝衰竭鼠,可以明显改善这些动物的短期存活率。但在肝损伤因素撤除后,受体肝内几乎见不到移植的细胞,移植后<月在脾脏见到畸胎瘤。这些研究证
实了23.潜在的治疗肝病的临床前景,但其远期疗效和致瘤性尚未得到解决。∃前景与展望
虽然目前以干细胞为基础的肝病治疗尚未进入临床应用阶段,但最近的研究报道提示,将干细胞
应用到肝病临床治疗前景看好,而要实现这一目标,必须解决以下几个问题%首先需要明确候选的
干细胞能够在体外形成功能性肝细胞,并且移植入肝脏后能够形成功能性的肝组织。同时,如何从体
外诱导分化放大的细胞中选择特异性的肝细胞也要相应加一解决 要进一步了解肝脏发育进程和干
细胞可塑性的分子基础,包括影响肝细胞形成的各类信号通路、转录调节网络、细胞外诱导信号及其
发生作用的时间、空间、剂量等程序性变化规律,以利增强干细胞向肝细胞的定向诱导分化!需进
一步阐明肝损伤和正常的肝再生过程干细胞的作用,移植后的细胞的长期命运也需要进一步在动物体
内进行评价,包括功能、可能存在的肝外定位、遗传和表遗传稳定性和致瘤性危险等。
随着对干细胞可塑性的深入理解与再认识,通过一定的方法与技术,也可能产生不遵循常规的干
细胞发育路线的肝细胞生成途径,从而使获得成熟肝细胞更为简捷。相信这些问题的逐一解决与基础
理论认识的突破,必将推动干细胞在肝病治疗中的广泛临床应用。
参考文献∀略#∃%%