DOI：10．3724/SP．J．1096．2011．01442超声波破碎-高效液相色谱法定量检测核酸

董莲华*盛灵慧王晶黎朋（中国计量科学研究院，北京100013）

摘要采用超声波破碎结合高效液相色谱技术，建立了定量检测质粒DNA的方法，测量结果可以溯源至核苷酸标准物质。采用超声波破碎（功率300W，频率24kHz）技术将质粒DNA破碎成200～500bp的小片段DNA，再用蛇毒磷酸二酯酶将其水解为4种核苷酸（dCMP：3．2min；dTMP：4．7min；dGMP：5．3min，dAMP：6．8min），将产物通过HPLC分离后，采用外标法进行定量分析。应用此方法对待测质粒pNK603进行定量分

析，测定的4种核苷酸的摩尔百分比（A∶T=0．95，C∶G=0．98）与理论值接近。本方法的测定结果（47．24!g/g）与实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR，45．98!g/g）和PicoGreen荧光染料法（46．02!g/g）的测定结果

没有显著差异，表明建立的超声波-HPLC方法可以应用于质粒DNA的定量分析。

关键词质粒；超声波破碎；高效液相色谱；荧光；聚合酶链式反应

2011-01-04收稿；2011-04-15接受

本文系科技支撑项目（No．2008BAK41B01）和博士科研专项基金（No．ATQDB0908）资助*E-mail：lianhuadong@gmail．com

1引言

核酸是生物遗传信息的载体，对核酸的定量分析是解析核酸结构和功能的基础。目前定量分析核酸的方法根据其原理的不同分为两类：一类是直接定量检测核酸，主要是通过应用标记探针的杂交反应进行定量检测；另一类是将待测核酸扩增后，再通过酶免疫法（EIA）、发光分析、荧光分析等方法定量检测扩增产物，主要是定量聚合酶链式反应（PCR）技术。在应用上述方法测定核酸含量时，其测量结果的溯源性、可比性还未引起关注。但是，在核酸标准物质制备过程中（如质粒分子标准物质），其核酸测量溯源的重要性就凸显出来。为了解决核酸定量测量的准确、溯源问题，各国都在进行探索。本研究试图通过色谱或质谱技术建立一个可溯源的高准确度的测量方法，即将双链的基因组或质粒核酸水解成单核苷酸，通过同位素稀释质谱法测定水解后的核苷酸的含量，据此计算核酸的浓度；还可根据核酸序列信息及4种核苷酸的摩尔浓度检查核酸水解是否完全。应用这种方法测定的结果可以溯源到核苷酸标准品，从而解决核酸测量的溯源问题。目前，应用同位素稀释质谱测定寡核苷酸（20mer）浓度的方法已经比较成熟［1］，但是对于双链，且

长度大于几百个碱基对的核酸片段的定量分析，除了紫外吸收法、定量PCR和荧光染料法外，由于缺乏相应的标准品，还没有其它成功的方法可用。长片段核酸无法直接完全酶解，因此，建立一个可以将长片段核酸碎裂为小片段核酸进而可以完全水解的方法，是实现大片段核酸的色谱、质谱及毛细管电泳定量分析的关键。本实验的目的是以质粒DNA为分析对象，利用超声波破碎技术将其破碎成小片段DNA，通过优化条件使其破碎后的产物可以进行完全酶解，酶解产物利用高效液相色谱（HPLC）进行定

量分析，以期建立一个溯源链清晰，准确度高的核酸定量测量方法。

2实验部分

2．1仪器与试剂

1200液相色谱仪（安捷伦中国有限公司）；酶标仪（M200，TECAN）、荧光定量PCR仪（AB7900HT，美国ABI公司）；JY92ⅡD超声波破碎仪（南京新辰公司）。TaqmanUniversalMasterMix试剂盒（4304437，美国ABI公司）；SB-AQ色谱柱（150mm×4．6mm，安捷伦中国有限公司）；特异性引物和探针

（上海英俊公司合成），其中探针5'端采用荧光标记基团FAM进行标记，3'端采用荧光猝灭基团TAMRA

第39卷2011年9月分析化学（FENXIHUAXUE）研究简报ChineseJournalofAnalyticalChemistry第9期1442～1446进行标记。具体序列见表1。乙腈（色谱纯）、蛇毒磷酸二酯酶（SVP）、4种核苷酸标准品，均购自美国Sigma公司。

表1NK603特异性序列和内源基因扩增引物和探针Table1PrimersandprobesforGM（geneticmodified）maizeNK603eventspecificgeneandendogenousgene

目标序列Targetgene定性/定量扩增Qualitative/quantitativeamplification引物/探针名称Primer/probe引物序列（5'-3'）Sequence（5'-3'）产物大小Product（bp）

zSSIIb定量PCR扩增QuantitativePCRzSSIIb-2F1-5'CTCCCAATCCTTTGACATCTGCzSSIIb-2R1-3＇TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGGzSSIIb-PFAM-AGCAAAGTCAGAGCGCTGCAATGCA-TAMRA151

［2］

NK603定量PCR扩增QuantitativePCRNK603-2F5'-ATGAATGACCTCGAGTAAG（T）CTTGTTAA-3'NK603-2R5'-AAGAGATAACAGGATCCACTCAAACACT-3'NK603-PFAM-TGGTACCACGCGACAGACTTCCACTC-TAMRA108

［3］

2．2实验方法

2．2．1超声波处理及酶解取2mL质粒pNK603DNA进行超声处理，重复7次。处理条件：功率

300W，频率24kHz，超声4s，间歇4s。工作时间50min。取超声波处理后的DNA样品60!L，加入8!LSVP（5mg/L）和8!LSVP缓冲液，37℃酶解3h，85℃酶解20min。设置3个平行，分别以不加SVP和不加DNA样品为酶解样品的对照。同时将未经

超声波处理的质粒DNA直接进行酶解作为超声波处理样品的对照。2．2．2HPLC分析将酶解后的样品经12000g离心2min，取上清液转入液相小瓶，上样进行HPLC分

析。流动相A：20mmol/L醋酸铵（pH3．5）；流动相B：乙腈。梯度洗脱：0～5min，100%A；5～10min，90%A；10～20min：90%A；20～25min：100%A。流速：1mL/mim，进样量20!L。检测波长254nm。2．2．3荧光定量PCR扩增及定量标准曲线的制作为了与HPLC方法测定质粒浓度结果进行比较，将相同的质粒DNA样品进行荧光定量PCR扩增，测定其浓度。采用表1中的引物和优化的扩增体系［4］进行PCR扩增。扩增条件：95℃，5min；45个循环：95℃，15s；60℃，1min。标准曲线的制作：将质粒DNA用荧光染料法测定浓度后，梯度稀释成5个标准溶液，采用上述条件和体系进行扩增，以初始质粒标准溶液浓度的对数为横坐标，以扩增得到的Ct值为纵坐标作图。

图1超声波处理质粒pNK603结果（1～7泳道分别为超声处理10min，15min，20min，marker，30min，50min，未处理质粒）Fig．1ElectrophoresesresultofplasmidpNK603treatedbyultrasonic（lane1to7areultrasonictreatmentfor10min，15min，20min，marker，30min，50minanduntreatedpNK603）

拷贝数（L）与质量浓度（C）换算公式：L=CDNA×6．02×1023/（3301×660）其中，CDNA为质粒浓度（g/L）；3301为质粒分子的碱基对个数；660为每个碱基对的平均分子量。2．2．4荧光染料法测定质粒DNA浓度采用PicoGreen试剂盒法对待测质粒DNA样品进行浓度测定，具体方法见PicoGreen操作说明书。

3结果与讨论

3．1质粒DNA的超声波破碎

将质粒DNA进行超声波破碎处理后，采用2．5%琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。第7泳道为未经处理的质粒，1～6泳道依次为超声处理10min，15min，20min，marker，30min和50min。由此可见，超声波处理50min后，质粒pNK603由原来的3．4kbp破碎成了主带在200～500bp的DNA片段。增加超声波处理功率，破碎结果没有

明显差异。另外，通过胶回收测定超声波破碎效率，发现超声波破碎质粒DNA的最佳浓度为30～90!g/g；浓度大于200!g/g，破碎的效率降至50%。

3441第9期董莲华等：超声波破碎-高效液相色谱法定量检测核酸3．2酶解及HPLC分离

将超声破碎后的DNA片段进行酶解，酶解后的产物经HPLC分离，分离结果见图2。图2a为4种核苷酸标准品的分离结果，根据出峰先后顺序，4个峰分别为dCMP（3．2min），dTMP（4．7min），dGMP（5．3min）和dAMP（6．8min）。图2b为质粒DNA破碎、酶解后产物的分离结果。质粒DNA经过超声波破碎和

图2核苷酸标准品及质粒pNK603水解产物的HPLC分离结果Fig．2SeparationofstandardnucleotidesandhydrolyzedproductsofpNK603byHPLC（a）．4种核苷酸标准品分离结果；（b）．超声波破碎处理质粒pNK603水解产物

分离结果；（c）．未经超声波处理质粒水解产物分离结果。（a）．separationofstandardnucleotides；（b）．hydrolyzedproductsofultrasonictreatedplasmidpNK603；（c）．hydrolyzedproductsofplasmidpNK603withoutultrasonictreat；theabscissaisretentiontime：min）

酶解后的产物为4种核苷酸，且4种核苷酸在该实验条件下得到了理想的分离效果。图2c为没有经过超声波处理的质粒直接酶解后的产物分离结果，该结果与超声波处理后进行酶解的质粒DNA水解结果不同，未有发现dTMP对应的吸收峰，而在保留时间为12．9，18．7和22．2min处出现了新的吸收峰，这表明

未经过超声波处理的质粒DNA直接进行酶解，没有完全水解。因此，超声波处理对质粒DNA的完全水解起关键作用，而质粒是否完全水解直接影响质粒DNA浓度的测定结果。3．3HPLC定量分析核苷酸

采用面积归一化法对超声处理的质粒DNA进行定量分析，4种核苷酸的标准曲线方程和线性相关系数见表2。4种核苷酸的标准曲线线性相关系数均

大于0．99，可见4种核苷酸的浓度与其峰面积的线性相关性很好。根据标准曲线产生的标准方程对质粒DNA水解后的4种核苷酸进行定量分析。4种核苷酸的质量浓度之和，即待测质粒的浓度（47．24!g/g）。测定的摩尔百分含量值与理论摩尔百分含量值非常接近。另外，根据测定结果计算出的A：T（0．95）和C：G（0．98）的值与理论值1也很接近。表2质粒pNK603的HPLC定量结果Table2ResultofplasmidpNK603quantificationbyHPLC