微卫星分子标记开发操作指南

1、250ng DNA酶切（DNA必须比较纯）

反应体系：ddH20 17.25µL

10X buffer R 2.5µL

MseⅠ(10U/ µL ) 0.25uL（ 2.5U）

DNA(50ng/µL) 5µL

总反应体系25µL , PCR仪 内37℃ ,3h酶切,65℃，15分钟失活。电泳检测：1.5%的琼脂糖，150V 电泳20min，点样量约9µL-10µL，剩余的15µL用于连接。

2、酶切后的产物连接。

反应体系： ddH20 8.8µL

MseⅠ接头 1uM (3µL) 即1pmol/µL

0.405nmol/μl = 405 pmol/μl

T4 buffer 3µL

T4 DNA ligase(5U/ µL ) 0.2µL(1u)

酶切后DNA 15 µL

总反应体系30µL , PCR仪 内37℃ ,2h或21℃，过夜连接，65℃10min失活。

MseⅠ接头5’-TACTCAGGACTCAT-3’/ 5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’

接头：10µL 100pmol/µL+90µLddH2O=100µL 10pmol/µL

3、连接的产物用灭菌蒸馏水稀释10倍（10µL酶切产物+90µL水）

4、稀释的连接产物预扩增。

反应体系： 无菌水 9.6µL

Taq DNA聚合酶 buffer 1 X 2µL

MgCl2 1.5mM 2µL

MseⅠ-N primer 120ng 1µL

dNTPs 200uM 0.2µL

Taq DNA聚合酶 0.4U 0.2µL

稀释的连接产物 5 µL 5µL

总反应体系20µL。

反应条件为： 94℃ 30s， 53℃ 60s，72℃ 60s，14-26个循环（循环数需优化14-17-20-23-26）

MseⅠ-N 引物为：5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’，N表示包括所有4种可能的选择碱基N=A，T，C，G,1.5%琼脂糖电泳检测

5、最佳反应条件下，PCR重新扩增一次，获得几百ng的扩增产物，试剂盒纯化。

6、杂交 * 5’端生物素化的探针的选择：常见的几种探针： （AC）15，（CT）15，（GA）15，（CAA）10，（AAG）8，（GATA）7，（ACCT）6

*250 ng -500 ng扩增的DNA与50-80 pmol 的生物素化的探针混合，加入总体积100 µL的SSC X4.2和SDS 0.07%中（即 21µL SSC X10加0.7 µL SDS 10%，加水至100 µL）。2 µg的DNA与200pmol 的探针在终体积500µL终浓度0.5 X SSC 溶液中，60℃杂交2小时。

* 95℃ 3min变性，室温，15min退火

7、富集

纯化的带接头的DNA（2-2.5微克）约30-50µL，95℃变性5分钟，与3’端生物素化的（CA）10或（GA）10 或5’生物素化探针（60℃杂交2h）200pmol（1µL）在50℃ 0.5倍SSC杂交1.5h,加入600µL的磁珠重悬于100µL的0.5 X SSC 溶液中，室温，20分钟。

300µL的预热至50℃的0.1 X SSC 溶液洗2次

300µL的0.1 X SSC 溶液室温洗2次

DNA洗脱至100µL的预热至50℃的双蒸水中，2次

试剂盒操作说明：

轻弹管底，使磁珠重悬，用磁场吸附磁珠,小心去上清（不能离心!!）

用300µL的0.5 X SSC 溶液重悬并清洗磁珠，磁场吸附，去上清(重复2次)

重悬于100µL的0.5 X SSC,加入DNA探针混合物

室温温育10分钟，每1-2分钟，倒置管子混匀

吸附磁珠，去上清

300µL的0.1 X SSC 溶液重悬并清洗磁珠，磁场吸附，去上清。重复3次，最后一次去上清尽量去干净（洗完后的上清保留以便查找实验故障的原因）

重悬于100µL的水中，轻弹管底是磁珠重悬

磁场吸附磁珠，上清液（我们需要的产物）转移至灭菌的管子中，保留磁珠。加入150µL的水，重复洗脱一遍，共得到250µL的产物

富集

* 1mg 的磁珠用TEN100（10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 100mM NaCl, pH

7.5）冲洗，重悬于40 µL的TEN100 中。

* 加入10 µL（约1 u g）的不相关的PCR产物（为了尽量减少非特异性结合的DNA）

* DNA-探针混合物用300 µL的TEN100稀释

* 稀释的DNA-探针混合物加入洗好的磁珠，室温温育30min，温育过程中不时温和搅拌(Incubate on rotator, or sideways in orbital

shaker on slow speed at 50 for 30 min.)

* 15000转，离心1min，（以便查找失败原因）

*非严格冲洗： 加入400µL的TEN1000（（10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA,

1M NaCl, pH 7.5）, 室温下轻柔混合5min，15000转，离心1min，上清转移至另一管中保存备用。重复2次。

*严格冲洗： 加入400µL的SSC 0.2 X，0.1% SDS，室温下轻柔混合5min，15000转，离心1min，上清转移至另一管中保存备用。重复2次。

8、加入50 µL TE （10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0），95℃ 温育5min，上清（里面包含我们需要的DNA）迅速转移并保存。

9、磁珠中再加入12µL的0.15 M的NaOH，加入适量的0.1167 M的醋酸（醋酸量事先用滴定法标定），最后加入TE 至总体积50 µL，95℃ 温育5min，保存。

10、所得DNA 加入10%体积的3M的乙酸钠，混匀。再加入1体积的-20℃预冷的异丙醇，室温过夜沉淀或-20℃沉淀30分钟，再用50 µL 灭菌蒸馏水溶解。

0.8%的琼脂糖电泳检测，DNA点样量2µL ，123bp Marker 3µL ,140v ，30分钟。理想的为弥散，否则考虑重做。

11、9、10所得的DNA分别PCR 扩增：

反应体系：Taq DNA聚合酶 buffer 1 X

MgCl2 1.5mM MseⅠ-N primer 120ng

dNTPs 200uM

Taq DNA聚合酶 0.4U

DNA 溶液 5 µL

总反应体系20µL。

反应条件为： 94℃ 30s， 53℃ 60s，72℃ 60s，30个循环

琼脂糖检测扩增产物，4中引物均应该产生大于200 bp 的弥散带（即最后一次严格冲洗后的上清液PCR扩增理想的结果是没有任何产物，表明非特异结合的DNA完全去除掉了）。

12 PCR产物的纯化，使用试剂盒，按说明书操作

13、利用TA cloning 克隆PCR扩增子，得到重组克隆，按说明书操作

14、转入感受态细胞。

* 从于37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑选一个单菌落，转到一个含有100 ml的LB 或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约3小时（旋转摇床，300转/分）。

* 在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次使用的、用水冰浴的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃

* 于4℃用Sorvall GS3转头以4000转/分，离心10ml，以回收细胞。一般情况每管装25毫升。注：离心一定要平衡！

* 倒出培养液，将管倒置1分钟，以使最后残留的培养液流尽。

* 每管用5 ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉淀，用灭菌的剪口的枪头轻柔搅动底部沉淀，并缓慢反复吸打几次使之混匀，放置于冰浴上10分钟。[用Mille-Q 级纯水配置的1M CaCl2 贮存液，以10 ml小份贮存于-20℃。制备感受台细胞时，取一小份融化，用纯水稀释至100ml（超净工作台上专用100 ml量筒现用现配），用0.45µm孔径的滤膜过滤除菌，然后骤冷到0℃即可。]

*于4℃用Sorvall GS3转头以8000转/分，离心6ml，以回收细胞。注：离心一定要平衡！ * 倒出培养液，将管倒置1分钟，以使最后残留的培养液流尽。

* 每50ml 初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉淀，用灭菌的剪口的枪头轻柔搅动底部沉淀，并缓慢反复吸打几次使之混匀。

* 用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200µL转移到无菌的微量离心管中。（若不马上进行转化，该感受态细胞可加入终浓度为20%的灭菌甘油，置于-70℃冻存。）每管中加连接产物10µL（体积〈10µL，DNA〈50 ng〉，轻轻旋转以混匀内容无，在冰上放置30分钟，（实验中设置阳性和阴性对照）

* 将管放到预先加温到42℃的循环水浴锅中放好的使馆架上，恰恰放90秒，不要摇动试管。

* 快速将管转移到冰浴中，是细胞冷却1-2分钟，。

* 每管中加入900µL的LB培养基，然后将管放置37℃培养箱的摇床上，转速不超过225转/分钟，使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。

* 4000转离心5分钟，弃上清

* 每管将适当体积的（每个90mm平板200µL）已转化的感受态细胞转移到含20 m M M g SO4 和相应抗生素的LB琼脂培养基上。（加入100 ML的LB培养基重悬或者直接吸出800µL，加入40µL 的X-gal 和4µL IPTG）

* 用无菌玻璃涂布器把溶液涂布于整个平板的表面。

* 将平板置于室温直至液体被吸收（大约10分钟）。

* 倒置平皿，于37℃培养，8-9小时后可出现菌落。

* 4℃将平板放置数小时，使蓝色充分显现。白色为阳性克隆（中间偶尔为淡蓝色，但外周无色），蓝色为阴性克隆（中间为淡蓝色，外周为深蓝色）。

15、 阳性克隆的挑选

，无菌条件下，用无菌牙签蘸一下白色菌落，置于含有氨苄青霉素的0.3 ml LB培养基的离心管中，37℃振荡，200-225转/分钟，培养3-4小时。