© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net香蕉转基因技术研究进展Ξ

金志强　徐碧玉(中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室,海口571101)摘　要:　香蕉具有高度不育性,难以通过传统育种的方法进行新品种的培育和遗传改良,因此转基因技术的建立尤为重要。综述近年来香蕉转基因技术,如受体材料、转基因方法、载体的构建等方面的研究进展。关键词:　香蕉　转基因　转基因香蕉ProceedingsinGeneTransformationofBananaJinZhiqiang　XuBiyu(TheNationalKeyBiotechnologyLaboratoryforTropicalCropsChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences,Haikou571101)Abstract:　Banana(Musaspp.)isoneofthemostimportantfoodcropsintheworld.Theapplicationofgenetransformationfortheimprovementofbananawouldbeausefultoolfortheintroductionoftraitsofinterestduetolowfertility,variouslevelsofploidyandlackofgeneticvariabilityinbanana.Someachievementsingenetransformationofhavebeenobtainedandthetechniquesingenetransformationstillwouldbedeveloped.Keywords:　Banana　Genetransformation　Transgenicbanana 广义的香蕉包括香蕉(Banana)和大蕉(Plan2tain)两大类。香蕉和大蕉属于芭蕉科(Musaceae)芭蕉属(Musa)[1]。几乎所有食用蕉都是由原始野生尖叶蕉(MusaacuminataColla)和长梗蕉(MusabalbisianaColla)自交或杂交后代进化而成的[2]。鲜食香蕉大多为三倍体AAA,即它们的染色体都来自尖叶蕉,是尖叶蕉自交或体细胞突变的后代。大蕉也是三倍体,染色体组成为AAB或ABB,即它们的染色体来自尖叶蕉和长梗蕉。除三倍体以外,还有二倍体AA、AB和四倍体AAAA、BBBB,但种类稀少[2]。栽培香蕉(Musaspp.)多为单性三倍体(AAA、AAB、ABB),具有高度不育性,传统的常规育种方法难于改良这些香蕉品种。其次香蕉是世界第四大粮食作物[3],具有重要的经济意义。第三,香蕉的果实是理想的植物生物反应器[4],利用香蕉果实生产人类疫苗和其他药用蛋白有着广阔的前景,因此香蕉的转基因技术研究尤其显得重要。关于香蕉的转基因方面的研究进展,目前所见的报道仍然不多。最早是Sagi等[5]于1994年作了这方面的研究工作。他们构建了3个质粒载体pBI221(35S→uidA→nos2T),pBI426[35S235S(AMV)→uidA2neo→nos2T],pBI505[35S235S(AMV)→uidA→nos2T],以来源于ABB型香蕉茎尖分生组织胚性悬浮细胞的原生质体为受体材料,通过电激法(electroporation)将上述3种质粒注入受体细胞,研究其瞬时表达情况。结果表明,在一定的电激条件下,可获得较理想的瞬间表达,并且发现带有35S235S启动子与AMV前导序列的uiA基因的瞬时表达效率明显高于只带35S启动子的uiA基因的瞬时表达效率。1995年,Sagi等[6,7]又相继选择了5个转化载体,采用基因枪法(particlebombard2ment)对同样的受体材料进行了轰击处理,检测到了报告基因的瞬时表达。2000年,Becker等[8]又作了相关的研究。他们取AAA型香蕉未成熟的雄花,先诱导胚性愈伤组织,再诱导胚悬浮细胞系,然后以此作为转移外源基因的的受体材料。同时构建了5个植物表达载体pBT6.32Ubi2NPT,pUbi2BTin2tORF3,pUbi2BTintORF5,pUGR73,pDHkan(其中Ξ国家自然科学基金资助项目(批准号:39960043)生物技术通报・综述与专论・ BIOTECHNOLOGY　BULLETIN 2003年第2期

© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.netBT6.3,ORF3,ORF5为香蕉束顶病病毒外壳蛋白基因的部分序列),采用基因枪法将这5个质粒轰击受体细胞。将轰击后的材料过渡培养10天,转入加有100mg/L卡那霉素的培养基上,3个月后(每月更换一次培养基)有抗性胚状体形成,在经过7个月胚萌发、4个月植株伸长及生根等选择培养,14个月后得到抗性植株。经过组织化学及分子生物学检测,证实外源基因已稳定整合入香蕉染色体,并在受体细胞中稳定表达。这几例研究工作都以胚性悬浮细胞为受体材料,从再生体系的建立到获得转基因植株约需三年半时间。我国学者徐立新等[9]及张银东等[10]以香蕉无菌苗基部新生的茎尖(2mm×3mm左右大小)作为受体材料,用基因枪将GUS及CMV2BH外壳蛋白基因导入受体组织,培养48小时后经组织化学检测,观察到经轰击的茎尖细胞中有明显的蓝色斑点。May等[11]初步建立了另一种外源基因转化香蕉的体系。他们构建了植物表达载体pBI141(Nos2pro→NPTII→Nos2ter———Actin2pro→GUS→Nos2ter);将采自大田香蕉(群型为AAA)吸芽中5mm长的茎尖接种到无菌培养基上,待长成植株时,取3～5cm长且带有2～4隔叶原基的顶端分生组织纵切为两块,充分暴露其分生组织,并将剩余球茎部分横切为2～3mm后的满圆片;以此为受体材料先用未包被外源基因的微弹轰击受体细胞,产生创伤后,再用加有乙酰丁香酮的(AS)的农杆菌液侵染,同时以直接用农杆菌侵染的植株作对照,最后都得到了抗性植株。经组织化学及分子杂交实验证明,所有的抗性植株都为外源基因稳定整合的转基因植株,只是先用微弹轰击后用农杆菌侵染植株的转化效率有所提高。该研究将技术相当成熟的香蕉再生体系及农杆菌介导的外源基因转移系统运用到了香蕉的遗传转化上。2001年,Ganapathi[12]等以质粒pVGSUN[ubi2als2nos3′2Gelvin2gusA/int2nos3′]转化AAB型的香蕉,pVGSUN载体上als基因作为选择标记,带有内含子的gusA基因作为报告基因,除草剂Glean作为选择剂。他们所用的受体材料是胚性悬浮细胞,采用的方法是农杆菌介导法。结果表明,共有16株植株经组织化学和分子生物学检测证实是转基因植株。其中的两株在温室中成熟,转基因的果实中检测到GUS的表达。综上所述可以看出,目前香蕉转基因研究中所采用的受体材料为三类:胚性悬浮细胞或原生质体、茎尖分生组织和茎微盘为受体材料。采用的转基因方法为:电激法、基因枪法、农杆菌介导法和基因枪与农杆菌介导相结合的方法。由于获得胚性悬浮细胞或原生质体所需时间较长,且操作较复杂,因此以茎尖分生组织和茎微盘为受体材料的转基因周期短,操作简便,有进一步深入研究的必要。在转基因研究中除了转化方法和受体材料以外,载体的构建十分重要,尤其是分离可以实现外源基因高效表达的启动子。上述转基因的例子中,在实验设计上也涉及各种启动子启动效率的研究。例如Sagi等[5]于1994年的转化研究结果说明35S235S启动子与AMV前导序列的uiA基因的瞬时表达效率最高。在他们随后的工作中[6,7]也证实,不同的启动子及其不同组合,转化效率也不相同。Dale[13]等分离了香蕉的肌动蛋白(ACTIN)基因并鉴定了其表达水平,组织特异性和上游调控序列。他们分离了Actin1的启动子序列,并将此序列分成三个不同长度的序列,分别与uidA报告基因构建了表达载体,以35S和ubi1启动子作为对照,研究了Actin1启动子的瞬间表达和在转基因植株中的表达情况。结果表明,带有全长启动子序列的Actin1启动子的表达载体,报告基因在转基因植株根和叶中高水平表达,类似于组成型表达,说明Actin1启动子在香蕉转基因研究中具有着较好的应用前景。DugDale[14]等比较了玉米ubi1,adh1,水稻的actin1和甘蔗的rbcS基因的含有内含子的5′非翻译区对香蕉束顶病毒DNA26的启动子(BT6.1)在香蕉胚性细胞启动活性的影响,结果表明,玉米ubi1和水稻的actin1的内含子使得内含子介导的GUS表达量达到最高水平,分别将BT6.1的启动活性提高了约100倍和300倍。在获得的转基因植株中,ubi1内含子显著促进BT6.1的启动活性,与CaMV35S启动子的活性相同而且不影响启动子的组织特异性。这些结果将有助于改进现有用于香蕉转基因研究中的转化载体。

参考文献1　华南农业大学主编.果树栽培学各论(南方本),农业出版社,1993,第二版,104.72003年第2期 金志强等:香蕉转基因技术研究进展

© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net2　SamsonJA.TropicalFruits,London:longman,1980,119.3　MoffatAS.Science1999,285:370～371.4　RichterL,MasonHS,ArtzenCJ.JTravelMed,1996,3:52～56.5　SagiL,RemySPanisB,etal.PlantCellReports,1994,13:262～266.6　SagiL,PanisB,RemyS,etal.Bio/Technology,1995,13:481～485.7　SagiL,RemyS,VerelstB,etal.Euphytica1995,85:89～95.8　BeckerDK,DugdaleB,SmithMK,etal.PlantCellReports,2000,19:229～234.9　徐立新,林栖凤,李冠一,等.海南大学学报(自然版),1994,4:308～310.10　张银东,张锡炎,曾宪松,等.热带作物学报,1995,16(增刊):19～25.11　MayGD,AfzaR,MasonHS,etal.Bio/Technology,1995,13:486～492.12　GranapathiTR,HiggsNS,Balint2KurtiPJ,etal.PlantCellRe2ports,2001,20:157～162.13　HermannSR,HardingRM,DaleJL.PlantCellReports,2001,20:525～530.14　DugDaleB,BeckerDK,MardingRM,etal.PlantCellReports,2001,20:220～226.・国外动态・利用噬菌体消灭对抗生素有抗药性的细菌ScienceNews2002年1月12日160卷2期23页报道:在大约1个世纪以前,生物学家发现某些病毒可吞噬细菌,并为此将这些病毒称为噬菌体。此后,生物医学家试图利用噬菌体消灭传染病的病原体———细菌。几十年之后,由于青霉素和其他抗生素的发现,使生物医学家们打消了这个念头。但现今由于越来越多的细菌对抗生素产生了抗药性,因而生物医学家们又再度萌发了利用噬菌体来消灭病原菌的设想,并且通过实验证明,噬菌体可防止小鼠因感染对抗生素有抗药性的病原菌后而发生死亡。利用噬菌体来消灭病原菌,一度成为风靡前苏联的治疗方法。但这种治疗方法带来的毒副作用或风险也是不容忽视的。到了20世纪90年代,美国马里兰州贝塞斯达市的美国国立卫生研究所的科学家CarlR.Merril及其同事,开始利用现代科技方法来改进噬菌体疗法。例如已分离出可以较长时间存活于动物血液的噬菌体。并用试验证明,这种噬菌体可使注射入致死剂量的大肠杆菌的小鼠免于死亡。此后,Merril等又与Carlton公司联手研究利用噬菌体消灭对抗生素有抗药性的肠球菌菌株,特别是可抗万古霉素的菌株,因为据悉,目前医院中病人的10%以上的感染,是来源于对万古霉素有抗药性的肠球菌。在InfectionandImmunity杂志2002年1月号上,Merril和Carlton公司等报道了利用噬菌体使小鼠成功地抵御对万古霉素和其他抗生素产生抗药性的粪肠球菌(Enterococcusfaecium)菌株的侵犯。他们将上述细菌接种于小鼠,又在45分钟后将可消灭这些细菌的噬菌体注射入小鼠体内。结果发现,接受噬菌体的小鼠有40%以上未发生感染而安全存活,而未接受噬菌体治疗的小鼠则在2天内死亡。还发现,即使延迟治疗1天,噬菌体仍可使50%的病情险恶的小鼠得以康复。Carlton公司等不仅在小鼠实验中未发现噬菌体疗法可产生严重的毒副作用,而且在2001年,Carlton公司曾将噬菌体多次注射于健康受试者,结果也证明其无毒副作用。Carlton公司还拟于今后在多家医院中观察噬菌体疗法对感染肠球菌的病人的治疗效果。虽然最近美国已批准2种新的抗生素用于消灭对万古霉素有抗药性的肠球菌,但事与愿违,某些肠球菌株系很快又对这些新的抗生素产生了抗药性。鉴此,Carlton公司建议,若将噬菌体疗法与化学药物疗法相结合,可望延长抗生素类药物的有效使用期。汪开8 生物技术通报Biotechnology　Bulletin 2003年第2期