毕业论文实验报告 学生姓名： 石书鹏 学 号： 20080357 学 院： 生命科学与技术学院
专 业： 08生物工程2班
论文题目： 木瓜多糖的提取工艺研究 指导教师： 吴耀辉 副教授 评阅教师： 王 卫 讲师
2012年4 月20日 本课题要研究或解决的问题和拟采用的研究手段（途径）： 本实验对木瓜中水溶性多糖的提取工艺进行了研究，多糖类化合物具有强亲水性，极易溶于水，和在亲水性比较强的乙醇中也难于溶解的性质，确定采用水提醇沉（水作为溶剂，乙醇来沉淀多糖）的方法提取多糖。分析提取时间、提取温度、固液比、提取次数对多糖提取率的影响，确定其最佳工艺条件。并且对多糖的抗氧活性进行探讨，为木瓜的综合利用提供依据。
1 材料与仪器 1.1 原料 新鲜木瓜
1.2 试剂 95 %乙醇，无水乙醇（分析纯），苯酚（分析纯），浓硫酸（分析纯），
蒸馏水，葡萄糖（分析纯）等 1.3 仪器 电子天平，粉碎机，鼓风干燥机，布氏漏斗，高速离心机，旋转蒸发仪，
恒温水浴锅，752C紫外分光光度计，滴管，移液管，漏斗，烧杯，滴定管，锥形瓶等。 2 实验方法 2.1 粗多糖提取及纯化步骤 2.1.1 木瓜处理 新鲜木瓜，洗净后，在温度50 ℃下烘干，经粉碎机粉碎后过60 目筛，收集粉末。 2.1.2 浸提 称取一定量的木瓜粉加入适量蒸馏水，在设定条件下恒温浸提，并不断搅拌。 2.1.3 过滤离心 将提取液用滤纸进行抽滤，弃掉滤渣,得澄清浸提液。浸提液用台式高速离心机进行离心5 min，转速3500 r/min。 2.1.4 浓缩 将离心后的浸提液放入旋转蒸发仪中浓缩到原体积的1/5。 2.1.5 醇沉 将浓缩后的提取液加入4 倍体积的 95 % 的乙醇溶液中，静置24 h以上。 2.1.6 离心 将用醇沉淀的多糖液离心，并用无水乙醇洗涤2 次～3 次，再次离心（转速3500 r/min，时间5 min），收集沉淀物。 2.2 粗多糖的含量测定方法 2.2.1葡萄糖标准曲线的绘制 精确取称110 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖标准品25 mg，置于250 ml容量瓶中，制得浓度为0.10 mg/ml的葡萄糖标准溶液，准确移取标准溶液0.00 ml、0.20 ml、0.40 ml、0.60 ml、0.80 ml、1.00 ml、1.20 ml、1.40 ml、1.60 ml、1.80 ml、2.00 ml浓度为0.10 mg/ml的葡萄糖溶液，分置于试管中，各加蒸馏水补足至每管2.00 ml。在各管中加入5.00ml显色液，然后振荡混匀，置于沸水浴中加热30 -35min，流水冷却，于波长490 nm处测定吸光度值。以吸光值A为纵坐标 溶液浓度 (mg/ml)为横坐标绘制标准曲线。 2.2.2粗多糖含量的测定 将纯化后的木瓜多糖粗品溶解，定容到100 ml。用移液管移取1.00 ml样液置于试管中，再用移液管加入显色液5ml，于沸水浴中加热30-35 min 后于波长为490 nm的分光光度计中测量吸光度。根据标准曲线、回归方程计算粗多糖含量，再由含量求出木瓜竹叶中多糖的含量。
计算公式为： C×V×n 木瓜多糖提取率= ×100% （1） m 式中： C — 提取液中木瓜多糖的浓度（g/ml） m — 称取的木瓜质量（g） n — 稀释倍数 V — 粗多糖（m1） 3实验结果 3.1葡萄糖标准曲线的绘制 表1 葡萄糖浓度与吸光度的关系 葡萄糖浓度mg/ml 0.0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08
吸光度/A 0.000 0.102 0.259 0.349 0.387 0.523 0.657 0.785 0.921 根据表1的数据，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，如图1。
y = 11.172x - 0.0043R2 = 0.9905
00.10.20.30.40.50.60.70.8
0.91
00.010.020.030.040.050.060.070.080.09葡萄糖浓度mg/ml
吸光度 /A
图1 葡萄糖标准曲线 由图1可知，葡萄糖与吸光度呈良好的线性关系，其回归方程： y=11.172x-0.0043 式（3） 相关系数:R2=0.9905 式中x为葡萄糖浓度，y为吸光度。
3.2不同单因素条件对木瓜多糖得率影响的研究 本试验首先主要考察几种对水浸提法提取木瓜多糖得率影响比较大的因素[44]，包括浸提温度、浸提时间、浸提时的液固比。从而找出这些因素影响木瓜多糖得率的大小和作用范围，为响应面实验的设计提供依据。
3.2.1浸提时间对多糖提取率的影响 以 1 g 木瓜粉末为基准，各加入50ml蒸馏水，在80。C下提取，分别考察提取时 间 1.0 h，2.0 h，3.0 h，4.0 h，4.5h，5.5h对多糖提取率的影响，再用苯酚-硫酸法测定其多糖的含量，最后分析结果。见表2与图2： 表2浸提时间与多糖吸光度提取率的关系 浸提时间 /h 1.0 2.0 3.0 4.0 4.5 5.5 提取率 % 7.40 8.00 7.20 8.10 9.60 9.30
图2不同浸提时间对多糖提取率的影响
由表2和图2可知：随着浸提时间的增加，多糖得率也增加，但当浸提时间达到4.5以后，多糖得率反而下降，故再增加提取时间对多糖得率增加不明显，说明多糖已经基本析出。
3.2.2温度对多糖提取率的影响 准确称取5份木瓜粉,每份 1 g，各加入50 ml蒸馏水，分别在温度50。C、60。C、70。C 、80。C 、90。C、95。C下提取4.5h，再用苯酚-硫酸法测定其多糖的含量，分析不同温度对多糖提取率的影响，结果见表3与图3: 表3 浸提温度与多糖提取率的关系 浸提温度 ℃ 50 60 70 80 90 95 提取率 % 4.30 5.70 6.20 6.30 6.00 5.80 34567405060708090100浸提温度 ℃
提取率 %
图3 不同浸提温度对多糖提取率的影响 由表3和图3可知：随着浸提温度的增加，多糖得率也增加，但当温度达到80℃以后，多糖被破坏，得率反而下降，故再增加浸提温度对多糖得率增加不明显，说明多糖已经基本析出. 3.2.3 浸提比对多糖提取率的影响 在温度为80℃ ，提取时间为4.5h条件下 ，考察了浸提比20：1，30:1 ，40:1，50：1 ，60：1 ml/mg情况下多糖的得率，浸提比对多糖提取率的影响结果见表4与图4。 表4 浸提比与多糖提取率及吸光度的关系 浸提比 ml/mg 20：1 30:1 40:1 50:1 60:1 提取率 5.26 6.41 6.58 6.44 6.08
图4 不同浸提比对多糖得率的影响 由表4和图4可知：随着浸提比的增加，多糖得率也增加，但当浸提比达到40:1以后，多糖被破坏，得率反而下降，故再增加浸提比对多糖得率增加不明显，说明多糖已经基 本析出。 3.3响应面试验 3.3.1 响应面设计 为了找到各个因素之间的相互影响, 我们在单因子试验的基础上进行响应面试验, 优化提取工艺。选择浸提时间，浸提温度，浸提比3个对多糖提取影响较大的因素 ,按表6设计三因素, 三水平实验，结果见表7。
表6 响应面分析因素与水平 因素 水平 -1 0 1 浸提时间 /h 4.0 4.5 5.0 浸提温度 /℃ 70 80 90 浸提比 / ml/mg 30：1 40:1 50:1
利用Design Expert软件进行多元回归拟合分析，得出多糖得率与浸提处理各因素变量的二次方程模型为： 多糖得率=27.75+0.31A+0.10B+2.13C+0.17AB-0.96AC+0.22BC-2.63A2-3.34B2-4.47C2 式中：A-为浸提时间 h ； B-为浸提温度 ℃ ； C-为浸提比 ml/mg 对表7数据进行方差分析。 方差分析及显著性见表8. 表7响应面分析方案及试验结果 Std Run Factor 1 A:浸提时间 h Factor 2 B:浸提温度 ℃ Factor 3 C：浸提比 ml/mg Response 1 多糖得率 % 1 1 4.0 70.00 40.00 21.8 9 2 4.5 70.00 30.00 18.381 7 3 4.0 80.00 50.00 23.47 13 4 4.0 80.00 40.00 24.2 3 5 4.0 90.00 40.00 21.5 17 6 4.5 80.00 40.00 27.81 10 7 4.5 90.00 30.00 18.281 16 8 4.5 80.00 40.00 27.8 4 9 5.0 90.00 40.00 21.8 6 10 5.0 80.00 30.00 20.3 14 11 4.5 80.00 40.00 28.8 5 12 4.0 80.00 30.00 17.4 8 13 5.0 80.00 50.00 22.55 12 14 4.5 90.00 50.00 22.2099 2 15 5.0 70.00 40.00 21.4 15 16 4.5 80.00 30.00 19.4 11 17 4.5 70.00 30.00 21.4099