2019年第14期广东化工第46卷总第400期www.gdchem.com·19·
依托泊苷脂质体的抗肿瘤活性研究
杨芸，黄颖，梁梦艺，李明娟，计燕萍，黄嬛(嘉兴学院医学院，浙江嘉兴314001)[摘要]目的：制备依托泊苷载药脂质体，并对其进行细胞药效学评价。方法：依据最佳工艺条件制备依托泊苷脂质体，并通过HPLC方法进行包封率和载药量的评价。将制备好的载药脂质体作用于小细胞肺癌H446细胞和人乳腺癌MCF-7细胞并计算IC50，比较该依托泊苷纳米脂质体对这两种肿瘤细胞的抑制作用。结果：制备得到的载药脂质体的包封率为79.77%，载药量为21.65%。细胞药效学评价实验表明，对H446细胞，游离药物和依托泊苷载药脂质体的IC50分别为2.40µg/mL和1.56µg/mL；对MCF-7细胞的IC50分别为1.28µg/mL和0.35µg/mL。结论：通过应用脂质载体对模型药物依托泊苷进行包裹，对H446和MCF-7两种肿瘤细胞的抑制作用显著增强。[关键词]依托泊苷；脂质体；抗肿瘤作用[中图分类号]TQ[文献标识码]A[文章编号]1007-1865(2019)14-0019-02
StudiesontheAnti-tumorActivityofLiposomalFormulationsofEtoposide
YangYun,HuangYing,LiangMengyi,LiMingjuan,JiYanping,HuangXuan(CollegeofMedicine,JiaxingUniversity,Jiaxing314001,China)
Abstract:Objective:ToprepareEtoposide-loadedliposomesbasedontheoptimalconditionspreviouslystudiedinourlaboratoryandtoevaluatetheirpharmacodynamics.Method:Etoposideliposomeswereprepared,theencapsulationefficiencyanddrugloadingwereevaluatedbyHPLC.ThefreeEtoposideanddrug-loadedliposomeswereappliedtosmallcelllungcancerH446cellsandhumanbreastcancerMCF-7cellsandtheIC50wascalculatedtocomparetheinhibitoryonthetwotumorcells.Results:Theentrapmentefficiencyoftheprepareddrug-loadednano-liposomeswas79.77%,andthedrugloadingefficiencywas21.65%.CellpharmacodynamicevaluationexperimentsshowedthattheIC50valuesofthefreeEtoposideanddrug-loadedliposomesagainstH446cellswere2.40μg/mLand1.56μg/mL,respectively;theIC50valuesoffreeEtoposideanddrug-loadedliposomesagainstMCF-7cellswere1.28μg/mLand0.35μg/mL,respectively.Conclusion:ByapplyingthenanostructuredlipidcarrierstothemodeldrugEtoposide,theinhibitoryofEtoposideonsmallcelllungcancerH446cellsandhumanbreastcancerMCF-7cellswassignificantlyenhanced.Keywords:Etoposide；liposome；anti-tumoractivity
依托泊苷(Etoposide)的化学名是9-(4,6-O-亚乙基-β-D-吡喃葡糖苷)-4’-去甲基表鬼臼毒素，是植物成分鬼臼毒素(Podophyllotoxin)的糖代谢产物[1]。依托泊苷是鬼臼毒素的半合成衍生物，属于细胞周期特异性抗肿瘤药物，它对于细胞周期晚S期或G2期有特异性的作用，有抑制DNA拓朴异构酶II的作用[2-5]，从而表现抗肿瘤作用。但该药物存在着比较存在严重的骨髓抑制、胃肠道反应，并损伤肝肾，属于典型的剂量限制性药物且在体内分布无选择性，高剂量治疗存在严重毒副作用。同时由于依托泊苷存在着剂型不稳定、水溶性差等问题，将其用载体包裹可以增加药物在体内的稳定性，改善安全性和稳定性。已有相关文献报道[6-8]对其进行制备得到微球制剂，可明显改善了药物在体内的配置，减少药物向体内的渗漏。本论文将通过制备依托泊苷载药脂质体，对其进行细胞药效学考察。1实验部分1.1实验试剂与实验仪器依托泊苷标准品(中国食品药品检定研究院，批号：100388-200401)；单硬脂酸甘油酯(国药集团化学试剂有限公司)；辛酸癸酸三甘油酯(GTCC，英国禾大公司)；泊洛沙姆(沈阳药科大学集绮药业有限公司)；色谱纯乙腈(FisherScientific)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；RPMI1640medium(HyClone公司)；0.25%胰蛋白酶溶液(吉诺生物医药技术有限公司)；青-链霉素溶液(吉诺生物医药技术有限公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma公司)。H446和MCF-7细胞(中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库)。高效液相色谱法(Infinity1260，安捷伦科技有限公司)；超声波细胞粉碎机(JY92-IID，上海比郎仪器有限公司)。1.2实验方法1.2.1载药脂质体的制备依托泊苷溶解于乙腈/水混合溶液中，配成浓度为1mg/mL的溶液，留以备用。分别精密称取适量单硬脂酸甘油酯和GTCC溶于乙醚，取800μL的0.1%F68水溶液与单硬脂酸甘油酯和GTCC乙醚溶液置于西林瓶中混合，精密移取200μL依托泊苷乙腈/水溶液加入上述液体，探头超声8min(300W，工作2s，间歇2s)。置于50℃水浴中加热，挥去乙醚，加入2mL的0.1%F68水溶液后盖上瓶塞继续搅拌3min，探头超声3min(200W，工作2s，间歇2s)，即得依托泊苷脂质体。取制得的依托泊苷脂质体上清液8000r/min离心10min，使附着于脂质体表面的游离药物颗粒通过离心去除。1.2.2包封率和载药量的测定取离心后上清液0.5mL，加入相同体积甲醇0.5mL，45℃左右水浴超声破坏10min。色谱条件：EclipsePlusC18色谱柱(4.6×100mm)，柱温为35℃；流动相为乙腈(25%)-醋酸pH=4.0缓冲液(75%)，流速为1mL/min，检测波长为254nm，进样量为20μL。用HPLC法测定总药物浓度(C0)。同时取离心后上清液，将其置于超滤离心管内，12000r/min高速离心10min，滤液用HPLC法测定游离药物浓度(C)。按公式(1)，(2)分别计算药物包封率(encapsulationefficiency,EE)和载药量(drugloadingcapacity,DD)。包封率(EE,%)=(C0-C)×V/m0×100%(1)载药量(DD,%)=(C0-C)×V/[(C0-C)×V+w]×100%(2)C0为破坏后药物总浓度，单位为μg/mL；C为未包裹的游离药物浓度，单位为μg/mL；V为载药胶束体积，单位为mL；m0为投入药物总量，单位为mg；w为载体质量，单位为mg。1.3细胞药效学测定将H446和MCF-7细胞分别常规培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，其中含有青霉素100IU/mL及链霉素100IU/mL，于体积分数5%CO2、37℃二氧化碳培养箱中培养，维持细胞处于对数生长期。调整细胞悬液浓度约为30000个/mL，分别接种小细胞肺癌细胞H446和人乳腺癌细胞MCF-7于96孔板，每孔加入0.1mL细胞悬液，置于5%CO2的37℃的孵箱中孵育培养。加入浓度梯度的药物，6个浓度梯度，每孔0.1mL，设5个复孔。加药后5%CO2的37℃的孵箱中孵育24~72小时，取出培养瓶置于倒置显微镜下观察。每孔加入10µLMTT溶液，继续培养4h。每孔加入100µL二甲基亚砜，在酶联免疫检测仪490nm和630nm两个波长条件下检测各孔溶液的光密度值，其中630nm处的OD值为调零组OD值。以不同药物浓度为横坐标，以细胞存活率为纵坐标作图绘制细胞生长抑制曲线。2实验结果2.1依托泊苷脂质体的包封率和载药量通过本法制备得到的载药脂质体的平均包封率为79.77%，平均载药量为21.65%(见表1)。[收稿日期]2019-05-28[基金项目]浙江省实验动物科技计划项目(2016C37109)[作者简介]杨芸(1987-)，女，浙江人，讲师，主要研究方向为靶向制剂。广东化工2019年第14期·20·www.gdchem.com第46卷总第400期
表1依托泊苷脂质体的包封率和载药量(n=13)Tab.1TheencapsulationefficiencyanddrugloadingofEtoposideliposome(n=13)名称包封率(Mean±SEM,%)载药量(Mean±SEM,%)依托泊苷脂质体79.77±1.0421.65±0.88
2.2游离药物和依托泊苷脂质体对小细胞肺癌H446细胞作用以小细胞肺癌细胞H446为细胞模型，对依托泊苷游离药物和依托泊苷脂质体进行细胞药效学评价(见表2)。在对H446细胞用药24h后，游离药物和载药脂质体的IC50分别为38.75µg/mL和10.97µg/mL；48h后的IC50分别为12.32µg/mL和7.73µg/mL；72h后的IC50分别为2.40µg/mL和1.56µg/mL。在药物作用24h、48h、72h后，对肿瘤细胞的IC50都依次降低，说明依托泊苷随着作用时间的延长对肿瘤细胞的杀伤力依次增大，且在三个时间点载药脂质体对H446细胞的作用均明显强于游离药物。
表2游离药物与载药脂质体对H446细胞的抑制作用Tab.2TheinhibitionratesoffreeEtoposideandliposomalformulationsofEtoposideonH446cellproliferationIC50/(µg/mL)24h48h72h游离药物38.7512.322.40载药脂质体10.977.731.56
2.3游离药物和依托泊苷脂质体对乳腺癌MCF-7细胞作用
表3游离药物和载药脂质体对MCF-7细胞的抑制作用Tab.3TheinhibitionratesoffreeEtoposideandliposomalformulationsofEtoposideonMCF-7cellproliferationIC50/(µg/mL)24h48h72h游离药物57.6111.341.28载药脂质体1.311.100.35
以小细胞肺癌细胞MCF-7为细胞模型，对依托泊苷游离药物和依托泊苷脂质体进行细胞药效学评价(见表3)。对MCF-7细胞作用24h后，游离药物和载药脂质体的的IC50分别为57.61µg/mL和1.31µg/mL；48h后的IC50分别为11.34µg/mL和1.10µg/mL；72h后的IC50分别为1.28µg/mL和0.35µg/mL。在药物作用24h、48h、72h后，游离药物和载药脂质体对肿瘤细胞的IC50都依次降低，说明依托泊苷随着作用时间的延长对肿瘤细胞的杀伤力依次增大，且在三个时间点载药脂质体对MCF-7细胞的作用均明显强于游离药物。3结论本实验制备得到的依托泊苷脂质体，其包封率为79.77%，载药量为21.65%。包封率和载药量佳，且理化性质较稳定。对制得的载药脂质体进行细胞药效学评价，结果表明对H446细胞，游离药物和依托泊苷质体的IC50分别为2.40µg/mL和1.56µg/mL；对MCF-7细胞，游离药物和依托泊苷脂质体的IC50分别为1.28µg/mL和0.35µg/mL。通过应用脂质载体对模型药物依托泊苷进行包裹，对两种肿瘤细胞的抑制作用均显著增强，有待进一步进行深入研究。
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(上接第29页)为准确评价鸡蛋花面膜液的保湿效果，通过检测使用面膜液60min后皮肤含水量、含油量的变化来评价其保湿性能，以使用后时间为横坐标，皮肤含水量增量、含油量增量为纵坐标，并与某款市售面膜做对比，其结果如图1所示：实验结果表明：测试者在涂敷本款产品和某款市售面膜液60min内其皮肤水分含量增量均有不同程度的提高，虽然涂敷市售产品5min后的水分和油分增量相对较高，但40min增量趋于平稳后，本款面膜液的保湿效果相对较好些。在平稳阶段，使用本款产品的测试者皮肤水分含量维持接近10%的增幅，可见，本款产品具备良好的保湿性。3讨论在面膜液基质筛选中，对面膜液的增稠体系、保湿体系、鸡蛋花总黄酮提取液加入量等都进行了探讨，决定选取增稠剂卡波U20、羟乙基纤维素复配，其用量分别为0.10%和0.30%；选取保湿剂甘油、1,3-丁二醇、山梨醇、透明质酸钠复配，用量分别为4.0%、6.0%、3.0%和0.15%；鸡蛋花总黄酮提取液用量为1%，浓度为1g/mL的鸡蛋花流浸膏。制得鸡蛋花面膜液进行各项理化指标考察，结果表明其各项指标都符合QB/T2872-2007标准，耐寒耐热实验中，均无异常情况出现，其稳定性良好。功效评价方面，通过对鸡蛋花面膜液进行DPPH自由基清除率、酪氨酸酶活性抑制率实验，结果表明本款产品有一定的抗氧化嫩肤与美白效果。保湿功效评价中，也表明本款产品保湿效果良好。这些都为本产品的开发提供了良好的理论基础，进一步的人体试用实验仍需考察。
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