牛分枝杆菌ag85b基因的瞬时表达宫强1,刘思国2　(1.河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳471003;2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,黑龙江哈尔滨150001

)

摘要　[目的]为牛结核病DNA疫苗的研制提供参考。[方法]利用PCR技术扩增出牛分枝杆菌ag85b基因片段,克隆到真核载体pcD2NA3.1(+)上,构建重组质粒pcAg85B,将重组质粒转染SP2/0细胞,间接免疫荧光试验检测该基因的表达情况。[结果]结果表明:在转染了重组质粒pcAg85B的SP2/0细胞中出现绿色荧光,说明ag85b基因在SP2/0细胞中成功进行了瞬时表达。[结论]为研究牛分枝杆菌ag85bDNA疫苗奠定了基础。关键词　牛分枝杆菌;ag85b基因;克隆;表达中图分类号　S858.23 文献标识码　A 文章编号　0517-6611(2008)21-08908-02

TransientExpressionofMycobacteriumbovisag85bGeneGONGQiangetal　(FoodandBioengineeringCollege,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,Henan471003)Abstract　[Objective]TheresearchaimedtoprovidereferencesfortheDNAvaccinedevelopmentofbovinetuberculosis.[Method]Theag85bgenefrag2mentamplifiedbyPCRfromMycobacteriumboviswasclonedintotheeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1(+),therecombinantplasmidpcAg85Bwasobtained.ThentherecombinantplasmidwastransfectedintoSP2/0cellsinvitro.IndirectimmunofluorescencewasusedtodetecttheexpressionoftargetproteininSP2/0cellstransfectedbypcAg85B.[Result]IndirectimmunofluorescencewhichusedtodetecttheexpressionoftargetproteinshowedSP2/0cellstransfectedbypcAg85Bappearedfluorescence.Sothetargetproteinhadbeensuccessfullyexpressed.[Conclusion]Thisstudylaidafoundationforag85bgeneDNAvaccineofMycobacteriumbovis.Keywords　Mycobacteriumbovis;ag85bgene;clone;expression

作者简介　宫强(1979-),男,山东泰安人,博士,讲师,从事动物病原分子生物学研究。收稿日期　2008204218

牛结核病是一种严重危害人畜健康的传染病,然而目前仍无一种疫苗可用于该病的预防[1]。传统的卡介苗(BCG)由于会干扰牛结核病的检疫,并不适用于预防该病[2]。因此,研制针对牛结核病的新型疫苗对于该病的预防和开发人结核病新型疫苗无疑具有重要的意义。该研究构建了牛分枝杆菌分泌蛋白基因ag85b的真核表达质粒pcAg85B,对其在SP2/0细胞中的表达进行了研究,为牛结核病DNA疫苗的研制奠定了一定的基础。1　材料与方法1.1　材料1.1.1　菌株与细胞。牛分枝杆菌ValleeⅢ菌株购自中国兽医药品监察所;大肠杆菌感受态细胞TG1和小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)由哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室细菌室(以下简称细菌室)保存。1.1.2　载体。质粒pET32a+和pcDNA3.1(+)由细菌室保存。1.1.3　试剂。TaqDNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶KpnI、EcoRⅠ、T4DNA连接酶及DL2000Marker购自大连宝生物工程公司,脂质体2000为Invitrogen公司产品,羊抗兔IgG2HRP和IgG2FITC为北京中杉金桥公司产品。1.2　方法1.2.1　重组质粒构建。设计合成牛分枝杆菌ag85b基因引物,以牛分枝杆菌ValleeⅢ全基因组DNA为模板,PCR扩增ag85b基因,引物序列如下,PU:5′2GTGGGGAATTCC2TAGCCGGCGCCTAACGAAC23′;PL:5′2GCGCGGTACCATGA2CAGACGTGAGCCGAAAG23′。PCR产物回收后以EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切,连接到真核载体pcDNA3.1(+)的相应位点,转化大肠杆菌感受态细胞TG1,抽提质粒酶切鉴定,阳性重组质粒命名为pcAg85B,进行序列测定。1.2.2　重组质粒的转染。将处于对数生长期的SP2/0细胞于转染前1d接种于24孔细胞培养板中,在5%CO2、37℃下孵育至细胞融合度约80%,取2μl脂质体2000和0.8μg重组质粒pcAg85B在200μl细胞培养液中充分混匀,室温作用20

min,加入800μl新鲜的完全培养液,混匀后加入细胞培养板中,37℃、5%CO2培养72h。设转染空载体pcDNA3.1(+)的细胞为阴性对照。1.2.3　Ag85B兔抗血清的制备。将ag85b

基因连接原核表

达载体pET32a+构建重组质粒pET32a

+2ag85b,转化入大肠

杆菌感受态细胞,诱导表达并纯化重组蛋白,用纯化的蛋白与矿物油混合制成疫苗免疫兔子,采用背部多点注射,共免疫3次,每次间隔2周,间接ELISA方法检测抗体效价后-20

℃保存备用。1.2.4　重组质粒的表达。转染了重组质粒pcAg85B的SP2/0细胞培养72h后,用70%的乙醇室温固定30min,加入1∶40

稀释的兔抗Ag85B血清,37℃湿盒内作用1h,加入1∶100稀释的含1%伊文斯兰的FITC标记的山羊抗兔IgG,湿盒内37

℃作用1h,洗涤后滴加碱性甘油,倒置显微镜下观察结果[3]。2　结果与分析2.1　重组质粒pcAg85B的构建　将PCR扩增的牛分枝杆菌ag85b基因(图1A)克隆到真核载体pcDNA3.1(+)上构建重组质粒,命名为pcAg85B,并进行双酶切鉴定,结果如图1B

所示。2.2　间接免疫荧光分析　转染了重组质粒pcAg85B的SP2/0细胞在倒置显微镜下可见到均匀的绿色荧光,表明该重组质粒在SP2/0细胞中获得了表达,所表达的蛋白可与兔抗Ag85B多抗发生特异性结合,而pcDNA3.1(+)转染的SP2/0细胞中无荧光出现,此结果表明牛分枝杆菌ag85bDNA能进入真核细胞并表达目的蛋白(图2)。3　结论与讨论Ag85B蛋白又称为MPB59,是牛分枝杆菌Ag85复合物中的一种主要成分,最早在结核杆菌和卡介苗(BCG)的培养滤液中发现。牛分枝杆菌在侵入机体后可分泌大量的Ag85B

安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2008,36(21):8908-8909 责任编辑　张彩丽　责任校对　傅真治蛋白,诱导细胞免疫,产生IFN2γ,其诱导的细胞免疫应答在抵抗牛分枝杆菌再次感染中具有重要作用[4]。该试验构建了真核表达质粒pcAg85B,并转入SP2/0细胞中进行了表达,

结果表明ag85b基因能成功在真核表达系统中表达相应蛋白,从而为研究牛分枝杆菌ag85bDNA疫苗奠定基础。

注:A与B中M为DL2000Marker,A中1与2为ag85b扩增产物,B

中1为pcAg85BKpnⅠ/EcoRⅠ消解的鉴别。Note:MinbothChartAandChartBisDL2000Marker;1and2inChartAaretheamplifiedproductsofag85bgene;1inChartBisthei2dentificationofpcAg85BbyKpnⅠ/EcoRⅠdigestion.图1　ag85b基因的PCR扩增(A)与酶切鉴定(B)

Fig.1　PCRamplificationandenzymedigestionidentificationofag85bgene

注:A为pcAg85B转染SP2/0细胞,B为pcDNA3.1(+)转染细胞。Note:A,SP2/0cellstransfectedbypcAg85B;B,SP2/0cellstransfectedbypcDNA3.1(+).图2　ag85b基因转染SP2/0细胞的免疫荧光结果Fig.2　Theimmunofluorescenceresultsofag85bgenetransfectedin2toSP2/0cells参考文献

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(上接第8869页)预报x1的因子是{x72,x8×x9},预报x2的因子是{x

10,x11,

x72,x4×x8,x7×x10,x5×x11},预报x3的因子是{x4×x8,x4