毕业设计（论文）卡拉胶裂解酶研究进展Advances on Carrageenase Research申请学位：学士学位院系：药学院专业：专升本药学姓名：贾云莉学号：112120109指导老师：武玉永（讲师）二〇一三年三月二十七日目录摘要 (3)前言 (3)1卡拉胶酶的分类及来源 (4)1.1 卡拉胶酶的分类 (4)1.2 拉胶酶主要来源 (4)2卡拉酶的性质 (5)2.1 酶学性质 (5)2.2 作用机理 (6)3 卡拉酶新研究 (7)3.1 卡拉胶酶的结构研究 (7)3.2 卡拉胶酶降解作用新机制 (8)4 卡拉胶酶的分子生物学研究 (9)5 分子生物学研究 (10)5.1 在卡拉胶结构研究中的应用 (10)5.2 作为海藻遗传工程的工具酶 (11)5.3 卡拉胶低聚糖的制备 (12)6 展望 (12)参考文献 (13)感言 (15)卡拉胶裂解酶研究进展摘要卡拉胶酶主要有κ-拉胶酶τ-卡拉胶酶．Λ-卡拉胶酶，是水解酶的一种 ,近年来，研究发现卡拉胶寡糖具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节及抗凝血等药理活性，有望成为新一代的海洋药物。
而卡拉胶酶可作为工具酶用于卡拉胶寡糖的制备，且有助于卡拉胶结构的研究；卡拉胶酶还可用于藻类原生质体的制备。
因此，卡拉胶酶的研究具有重要的理论意义和明确的应用前景。
本论文从卡拉胶酶的分类及家族归属、来源、性质、分子生物学研究以及应用等方面综述了近年来国内外卡拉胶酶的研究进展情况。
关键词卡拉胶酶；家族；寡糖；来源；性质前言卡拉胶酶属于一种多糖水解酶，可以降解卡拉胶的β一1．4糖苷键，生成卡拉胶低聚糖。
1，3-β-D一吡喃半乳糖和1，4一α—D一吡晡半乳糖作为卡拉胶酶的基本骨架，交替连接而成的线性硫酸多糖，主要存在红藻纲中的卡帕藻属、麒麟菜属、角叉菜属等生物的细胞壁中。
可以根据是否含有3，6一内醚半乳糖结构和硫酸基的含量和位置的不同，卡拉胶分为十几种类型，目前工业生产和使用的主要有κ一型、ι一型和λ一型三种，其二糖单元分别有1个、2个、3个硫峻基。
与很多硫酸多糖、硫酸低聚糖及其衍生物类似，卡拉胶寡糖在抗病毒、抗肿瘤、免疫凋节、抗凝血以及诱导植物胚胎发育过程中小孢子形成等可发挥重要作用，尤其是ι、λ卡拉胶寡糖，它们均含有多个硫酸基，可能具有更好的生理活性，引起了人们的极大关注，已经成为医药、农业、食品等领域研究与开发的高科技竞争热点。
但是，传统的化学和物理降解方法反应条件不易控制、产物分布不均匀，根本无法进行大量高纯度寡糖的制备。
所以，反应条件温和，底物专一的卡拉胶酶对于卡拉胶寡糖的构效研究乃至进一步应用开发的主要瓶颈因素具有深远的理论意义和应用价值。
1 卡拉胶酶的分类及来源1.1 卡拉胶酶的分类根据酶解底物的专一性质，κ-卡拉胶酶，τ-卡胶酶，Λ-卡拉胶酶等。
卡拉胶是由1，3．B．D．吡喃半乳糖和l，4-0．D．吡喃半乳糖交替连接而成的线性硫酸多糖，用S(35)标记的卡拉胶可检测到水解硫酸酯键的酶类（1）。
ιι-卡拉胶酶专门水解α-3，6一内醚一D一半乳糖和β-4一硫酸一D．半乳糖之间的β一1，4一糖苷键，生成以ι一硫酸新卡拉寡糖为主的终产物，λ-卡拉胶酶特异性降解α一2，6一硫酸一D 一半乳糖β一2一硫酸一D一半乳糖之问的β-1，4一糖苷键，生成以λ一硫酸新卡拉寡糖为主的终产物（2）。
日前所发现的卡拉胶酶大多数是κ-卡拉胶酶，只有2种ι-卡拉胶酶和1种κ-卡拉胶酶。
1.2 卡拉胶酶主要来源较多的来源于微生物和海洋动物。
微生物来源的卡拉胶酶, 目前已从假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)噬纤维菌属(Cytoph aga)、交替单胞菌属(Alteromonas carrageenovora) 弧菌(VibfioZo –belliagala ctanovorans)和假单胞菌属(Pseudo monas Carageeno vora)等中发现卡拉胶酶，部分报道表明，海洋软体动物也能分泌卡拉胶酶，Mori(1943)曾用海洋软体动物中的水解酶(其中有卡拉胶酶)处理皱渡角叉菜(Chondrus crispus)提取多糖（3）。
在新西兰食草鱼内脏中也发现有卡拉胶酶存在，海洋Cellulophaga sp．QY201产生ι-卡拉胶酶的发酵条件优化水研究该菌株发酵条件的优化，确定了菌株产酶的最佳发酵条件（4），在优化的产酶培养基和培养条件下，即K一卡拉胶为5 g／L、蛋白胨3 g／L、NaNO3l L、NaCI 20 g／L、K2HPO4·3H2 O 1 g／L、MgSO4·7H2O 0．5 g／L和CaC12 0．1 g／L，摇床转速为150 r／min、装液量50 mL、接种量4％、发酵培养基起始pH 7．5、温度28℃和培养时间28 h时，测定的HCA 菌株发酵液的最高酶活力(602．30U／mL)是优化前该菌株酶活力(5O．75 U／mL)的11．87倍，高于牟海津等¨报道的卡拉胶降解菌M一2菌株的酶活力。
试验结果为酶的分离纯化及酶解产物的制备提供了依据（5）。
2 卡拉胶酶的性质2.1 酶学性质Potin P等1991年报道从红叶藻属(Delesseria sanguinea)SY离了一株能够降解不同硫酸化半乳糖聚合物(琼胶或卡拉胶)的细菌，用硫酸铵．凝胶过滤色谱(Sephacryl S 200 HR)，离子色谱(DEAE—Sepharose—CL6B)纯化κ-卡拉胶酶，用SDS／PAGE电泳检测为单一蛋白质，测定酶分子量为40．000，最适pH7．2，30~C稳定但在400(2只维持lh（6）。
SarwarG 等1 987年报道用221 6E培养基添加商业0.1卡拉胶培养噬纤维菌属的细菌Cytophaga sp．1k—C783，分离胞外卡拉胶酶。
用硫酸铵沉淀，离子交换色谱，凝胶过滤色谱(G-200)纯化得到κ卡拉胞酶，纯化的酶分子量用SDS／PAGE电泳测定为100000，卡拉胶酶的最适pH为7．6，最适温度为25℃。
金属离子对Cytophaga，lk-C783生长的影响，NaC1和MgCl2可被细菌利用，2216E中培养基最小浓度0.05mol／L NaC1，0．25MgC12（7）。
KC1和CaC12对产酶没有作用，当营养物质充足的时候，卡拉胶酶在休眠和生长的细胞都可合成和释放。
从海洋细菌卡拉假单孢菌(Pseudomonascarrageenovo —ra)分离得到能降解κ卡拉胶的酶系，经硫酸铵浓缩，羟基磷灰石色谱分离，再经DEAE。
纤维素色谱层析分离，可得到凝胶电泳纯的κ一卡拉胶酶。
该κ一卡拉胶酶可使卡拉胶降解，使其粘度急剧下降，还原糖含量增加，降解产物用薄层色谱法确定为含硫酸寡糖同系物，即以3．0．(3，6．内醚一α．D．半乳糖基)．4-硫酸基．B．9．半乳糖(也可称为4．硫酸基一新卡拉二糖)为主要酶解产物。
改进了从卡拉假单孢菌分离κ卡拉胶酶的方法。
把培养液用硫酸铵沉淀，以CM—Sephadex CL．6B离子交换柱层析分离处理，以氯化钠梯度洗脱。
洗脱液中的酶组分经电泳证实为单体的κ卡拉胶酶，分子量为35kDa。
该酶的降解产物为4．硫酸基一新卡拉二糖。
从刺麒麟菜提取的ι卡拉胶上生长的一种海洋细菌培养液中分离得到ι一卡拉胶酶。
将该酶提取液以2．0mol／L为提取液，在Sephacryl S-200离子交换柱进行层析提纯处理，用凝胶电泳验证该ι卡拉胶酶为单一酶组分（8）。
将κ一卡拉胶和ι一卡拉胶用κ一卡拉胶酶和ι卡拉胶酶处理，其酶解产物含硫酸基的κ卡拉二糖、含硫酸基的κ一卡拉四糖、ι一新卡拉二糖和ι一新卡拉四糖。
2.2 作用机制根据水解过程异头碳的构象是否发生改变，可将糖苷水解酶的作用机理分为保持型和倒置型两种（9）。
1995年，Potin等人利用凝胶过滤色谱和13C-NMR对fortis κ一卡拉胶酶水解新卡拉六糖做了分析，结果表明反应开始时形成β-新卡拉二糖和β-新卡拉四糖，异头碳的构象没有发生变化。
说明了κ-卡拉胶酶是以保持异构构型的分子机制进行水解的，且目前已经发现的GH-16家族的糖苷水解酶作用机制均为保持型（10）。
同时，他们又对ι卡拉胶酶进行了研究，发现它是通过异构构型全部转换的方式降解ι-卡拉胶，使其内部的β-(1-4)连接断裂。
2007年，Guibet等人通过核磁共振氢谱分析，说明car-rageenovora -卡拉胶酶的作用方式也是转换型的分子机制（11）。
3 卡拉酶新研究3.1 卡拉胶酶的结构研究1998年的P.carrageenovo—ra κ-卡拉胶酶的品体结构测定研究了卡拉胶酶的三维结构。
通过x一射线衍射和多波长不规则衍射(MAD)技术，发现它折叠成一个弯曲的β-三明治，球状结构几乎全部由β一折叠和表面loop组成，其中每一个β一折叠片层由6或7个β链组成，κ卡拉胶酶的这种三维结构与其它GH一16家族中已知晶体结构的酶相比有很大的相似性。
不同之处是，这种三明治结构中的B一折叠片两两反向堆积，酶的裂缝处部分被覆盖成了环型通道，形成了隧道状的催化腔，而且，有一个精氨酸残基在底物的1位置处，用来识别β一连接的卡拉胶单体中的硫酸酯基取代物。
2000年Michel等又对A．fortis L 一卡拉胶酶的晶体结构进行了分析该酶折叠成右手平行的β一螺旋结构，由10个完整的转角和表面loop组成；核心是三个平行的β一折叠片组成，其中一个折叠片嵌于另外两个平面彼此垂直的折叠片形成的凹槽(12)。
研究认为，在前者上有寡糖存在，推测这个凹槽很有可能就是底物的结合位点。
和其他大部分β一螺旋蛋白一样，ι-卡拉胶酶在N一末端区域存在一个两亲性α-螺旋；而不同的是，其C一末端区域是高度复杂的，是运用了一种α/β折叠形式。
3.2 卡拉胶酶降解作用新机制κ-卡拉胶酶和ι-卡胶酶的活性中心均为隧道状结构，从而保证多聚体糖链能够从此处通过。
这种环形结构使酶活性中心位于隧道内侧，以保证酶在释放产物后仍然能牢固结合在多糖链上，从而使酶的催化反应得以继续进行：这种酶反应的可持续性性质是保证卡拉胶酶能有效降解卡拉胶凝胶的关键凶素，如此特殊的结构只在纤维素酶中有过报道。
Michel等(2003)用电子显微镜(electron—microscopy analysis)分析了ι-卡拉胶纤维的降解，发现糖链沿着B一螺旋凹槽移动，与酶相互作用，从而形成酶一底物结合的开放型模式；随着反应的进行，酶折叠成闭合型的作用模式，使得糖链发生降解后并不脱离酶作用位点，催化反应继续进行；表明L一卡拉胶酶属于行进型(processive mecha—nism)的糖苷水解酶。
（13）4 卡拉胶酶的分子生物学研究至今为止，少数几种卡拉胶酶的基因得到了克隆和测序。