中国饲料２００８年第８期＊通讯作者乳酸菌是机体肠道正常菌群中的优势菌，能够产生有机酸（如乳酸、乙酸、丙酸等）、双乙酰、过氧化氢等化合物，能够抑制腐败菌和病原菌。大肠杆菌在正常条件下是机体肠道的正常菌群，但在异位时或当机体抵抗力下降时又可能成为条件致病菌，引起各种感染（凌代文，１９９１；Ｓｏｒｒｅｌｓ和Ｓｐｅｃｋ，１９７０）。研究表明，乳酸菌通过自身的生长繁殖及其所产生的代谢物等，达到改善动物胃肠道内部微环境、降低ｐＨ值和抑制有害菌生长，对肠道细菌如大肠杆菌、沙门氏菌引起的疾病有治疗和保健作用（Ｂｌｏｍｂｅｒｇ等，１９９３）。本文旨在通过乳酸菌的体外抑菌试验，探讨乳酸菌菌液及其代谢产物对致病性大肠杆菌的抑制特性。１材料与方法１．１试验菌株及培养条件乳酸杆菌为乳酪杆菌，鸡致病性大肠杆菌为鸡志贺氏大肠杆菌。培养乳酸菌专性培养液（ＭＲＳ）组成为：胰蛋白胨１０ｇ，牛肉蛋白胨１０ｇ，酵母浸出物５ｇ，葡萄糖２０ｇ，吐温（８０）１ｍＬ，磷酸氢二钾２ｇ，乙酸钠５ｇ，柠檬酸钠２ｇ，硫酸镁２００ｍｇ，硫酸锰５０ｍｇ，定容至１Ｌ，ｐＨ为６．２～６．６。培养条件为３７℃，厌氧静止培养１８～２４ｈ。ＬＢ培养基的组成为：胰蛋白胨１０ｇ，酵母浸出物５ｇ，氯化钠１０ｇ，定容至１Ｌ，ｐＨ为７．０。培养条件为３７℃，摇床培养（１５０ｒ／ｍｉｎ）１８～２４ｈ。１．２根据抑菌环直径大小判定抑菌能力的强弱１．２．１乳酸杆菌菌液的制备取０．１ｍＬ乳酸菌接种在２００ｍＬＭＲＳ液体培养基中，３７℃厌氧培养２４ｈ，然后进行抑菌试验。１．２．２乳酸杆菌代谢产物的制备将上述各时间段培养的乳酸菌菌液取出３ｍＬ，然后以１３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清液用滤菌膜过滤，即为乳

酸杆菌代谢产物。１．２．３营养琼脂培养基的准备称量２ｇ酵母、１ｇ氯化钠、１ｇ胰蛋白胨、４ｇ琼脂，置于２５０ｍＬ的三角瓶中，再加入２００ｍＬ蒸馏水配制成溶液，高压灭菌。之后将灭菌过的营养琼脂液倒入１２个平皿中，待用。１．２．４对大肠杆菌的抑菌试验取２００μＬ大肠杆菌培养物，用无菌的Ｌ型玻璃棒将其均匀抹在营养琼脂培养基上，待干后打孔。在平皿底部分区（分四个区），用金属管在每个区打３个孔，孔径为

乳酸菌及其培养物对鸡致病性大肠杆菌的抑菌试验郑州牧业高等专科学校郭金玲河南农业大学牧医工程学院郑秋红刘香尹清强＊商丘市饲料监测站董良奇

［摘要］本试验研究了乳酸菌、乳酸菌上清液、抗生素及ＭＲＳ对照液对鸡致病性大肠杆菌的体外抑菌作用。结果表明，乳酸杆菌菌液及培养后的无菌上清液都有较强的抑菌活性，其抑菌圈的直径显著大于对照组（Ｐ＜０．０５）；且随着乳酸菌培养时间的不同，乳酸菌培养液的ｐＨ值逐渐降低，对致病性大肠杆菌的抑制作用也逐渐增强。［关键词］乳酸菌；鸡致病性大肠杆菌；体外抑菌试验［中图分类号］Ｓ８１６．７［文献标识码］Ａ［文章编号］１００４－３３１４（２００８）０８－００３４－０３［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｎｄｉｔｓｓｕｐｅｒｎａｎｔ，ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃａｎｄＭＲＳｍｅｄｉｕｍｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｓｔｕｄｙｇｒｏｗｔｈｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃＥ．ｃｏｌｉｏｆｃｈｉｃｋｅｎ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｎｄｉｔｓｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｈａｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｎｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃＥ．ｃｏｌｉ．ＴｈｅｄｉａｍｅｔｅｒｓｏｆｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｚｏｎｅｓｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｎｄｉｔｓｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｗｅｒｅｌａｒｇｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ；ｔｈｅｐＨｖａｌｕｅｓａｎｄｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆＥ．ｃｏｌｉｄｅｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｔｈｅｅｘｔｅｎｓｉｏｎｏｆｉｎｃｕｂａｔｉｎｇｔｉｍｅ．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ；ｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃＥ．ｃｏｌｉｏｆｃｈｉｃｋｅｎ；ｇｒｏｗｔｈｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＥ．ｃｏｌｉｉｎｖｉｔｒｏ

３４中国饲料２００８年第８期

（下转第４０页）培养时间０ｈ６ｈ２４ｈ４８ｈ７２ｈ大肠杆菌＋乳酸菌５．０２５．１６５．６９５．８３５．８４乳酸菌４．９６４．９１４．９０４．８１４．８１大肠杆菌＋乳酸菌上清液５．１１５．０３４．８５４．８３４．８３大肠杆菌７．３６８．２４８．９０９．０５８．８９注：同列数据肩标不含相同小写字母表示差异显著（Ｐ＜０．０５），含相同字母或无字母标注表示

差异不显著（Ｐ＞０．０５）；下同。

乳酸菌原液８．１±１．０８．２±０．６９．９±０．７８．０±０．９８．６±０．９ａ乳酸菌上清液７．３±０．４７．９±０．９８．７±０．５８．５±０．８８．１±０．６ａ抗生素８．５±０．５８．９±０．７９．４±０．２１０．７±１．０９．４±１．０ｂＭＲＳ对照液７．２±０．１７．７±０．６７．４±０．２７．４±０．４７．４±０．２ａ

１２ｈ２４ｈ４８ｈ７２ｈ培养时间平均数

表１乳酸菌及其上清液、抗生素、ＭＲＳ对照液对大肠杆菌所产生的抑菌圈的大小（ｎ＝３）

ｍｍ

图１不同培养时间段的光密度值

培养时间０ｈ２４ｈ４８ｈ大肠杆菌＋乳酸菌（３．７１±０．４５）×１０７ａ（５．６５±０．７６）×１０４ａｂ（１．１７±０．２３）×１０３ａ乳酸菌（１．２５±０．２１）×１０４ｂ（８．３３±０．８４）×１０３ａ（３．１７±０．４１）×１０３ａ大肠杆菌＋乳酸菌上清液（３．６３±０．４４）×１０７ａ（１．４７±０．３５）×１０５ｂ（８．３３±０．９０）×１０３ａ大肠杆菌（８．７１±０．９２）×１０７ａ（１．４１±０．２５）×１０８ｃ（１．８８±０．３１）×１０９ｂ

表２不同时间段培养液的活菌数变化个／ｍＬ

大肠杆菌＋乳酸菌乳酸菌大肠杆菌＋上清液大肠杆菌

８７６５４３２１０

ＯＤ值

０６２４４８７２时间（ｈ）

表３不同时间段培养液的ｐＨ值变化

７．０ｍｍ，再用镊子将孔内琼脂块挑出，然后封底。在４个区的孔内分别加入乳酸菌原液、乳酸菌上清液、抗生素、ＭＲＳ对照液。３７℃培养１６ｈ，观察抑菌圈大小并用游标卡尺测量其直径，根据抑菌圈直径大小作为判定其抑菌能力的强弱。１．３利用液体培养的方法测定抑菌能力的大小制取４个５０ｍＬＬＢ液体培养基，标号１、２、３、４。１号管加入１ｍＬ乳酸菌和２００μＬ致病性大肠杆菌，２号管加入１ｍＬ乳酸菌和２００μＬ无菌蒸馏水，３号管加入１ｍＬ乳酸菌上清液和２００μＬ致病性大肠杆菌，４号管加入２００μＬ致病性大肠杆菌和１ｍＬ无菌蒸馏水。随即取样测量光密度值、菌数及ｐＨ值，再置３７℃厌氧培养６、２４、４８、７２ｈ，测定各不同时间段的活菌数、光密度值（ＯＤ值）、ｐＨ值。１．４统计分析数据经Ｅｘｃｅｌ软件初步整理后，利用ＳＰＳＳ１０．０单因子方差分析中ＬＳＤ法进行统计分析。２结果与讨论２．１乳酸菌原液、乳酸菌原液上清液、抗生素、ＭＲＳ对照液对致病性大肠杆菌的抑制作用见表１。表１表明，乳酸菌原液、乳酸菌原液上清液和抗生素对致病性大肠杆菌都有一定的抑制作用，其中以抗生素的抑制效果最好。２．２不同时间段的活菌数、光密度值、ｐＨ值变化见表２、图１和表３。由表２可知，培养液中的活菌数随着培养时间的增加变化显著，大肠杆菌＋乳酸菌、乳酸菌、大肠杆菌＋乳酸菌上清液处理组的活菌数，随培养时间的延长不断减少；而只含有大肠杆菌的处理组的活菌数不断增加，这说明乳酸杆菌及其上清液对致病性大肠杆菌有明显的抑制作用。从图１可知，不同时间段培养液的ＯＤ值变化趋势虽然是相同的，但２４ｈ后只含有大肠杆菌的ＯＤ值大于其他各组。这说明大肠杆菌在没有加抑制剂的情况下，其生长速度比添加有抑制剂的快。也就是说，乳酸菌原液及上清液、抗生素对致病性大肠杆菌有明显的抑菌作用。

从表３可知，大肠杆菌＋乳酸菌、乳酸菌、大肠杆菌＋乳酸菌上清液处理组的ｐＨ值，随培养时间的延长变化幅度不大，但与只含有大肠杆菌的处理组相比仍显得很低，这一结果与大肠杆菌的活菌数低相一致。这说明乳酸菌对致病性大肠杆菌的抑菌作用可能与乳酸菌产酸有关。

３讨论本试验结果表明，乳酸菌原液及乳酸菌原液上清液具有与抗生素同样的抑菌作用。从抑菌圈的大小来看，乳酸菌原液和乳酸菌原液上清液的抑菌作用低于抗生素。另外，乳酸菌原液和乳酸菌原液的上清液抑菌作用无显著差异，说明乳酸菌的抑制作用有可能与其在培养过程中产生的代谢产物（乙酸、乳酸、丙酸等）密切相关。培养液中低

３５中国饲料２００８年第８期ｐＨ值和低大肠杆菌活菌数相一致，也充分证明了这一论点的正确性。本试验结果与丁轲等（２００３）报道相似，而与王传彬等（１９９７）的研究报

道不一致。本研究证实，乳酸菌完全可以替代抗生素作为饲料添加剂和抑菌剂，对无公害畜产品的生产具有重要的意义。参考文献［１］丁轲，倪学勤，潘康成，等．三株乳酸杆菌体外抑菌试验的研究［Ｊ］．饲料工业，２００３，２４（３）：１９～２１．［２］凌代文．乳酸细菌分类鉴定及实验方法［Ｍ］．北京：中国轻工业出版社，１９９１．１１７～１８１．［３］王传彬，王永坤，朱国强，等．动物源乳酸菌筛选及生物特性参数测定［Ｊ］．江苏农学院学报，１９９７，１８（１）：１～５．［４］ＢｌｏｍｂｅｒｇＬ，ＨｅｎｒｉｋｓｓｏｎＡ，ＣｏｍｖａｙＰＬ．ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆａｄｈｅｓｉｏｎｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ８８ｔｏｐｉｇｌｅｔｉｌｅａｌｍｕｃｕｓｂｙＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ．［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９３，１：３４～３９．［５］ＳｏｒｒｅｌｓＫＭ，ＳｐｅｃｋＭＬ．ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａｇａｌｌｉｎａｒｕｍｂｙｃｕｌｔｕｒｅｆｉｌｔｒａｔｅｓｏｆＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｒｃｉｒｔｒｏｖｏｒｕｍ［Ｊ］．ＤａｉｒｙＳｃｉ，１９７０，５３：２３７～３４３．［通讯地址：郑州市文化路９５号，邮编：

４５０００２］

表１流动相梯度时间（ｍｉｎ）乙腈磷酸／三乙胺溶液（含１％乙腈）０７９３３６９９１６０１３８７

表２混合标准液中各组分出峰顺序出峰顺序１２３４５６７８９名称氧氟沙星诺氟沙星培氟沙星环丙沙星洛美沙星达氟沙星恩诺沙星沙拉沙星二氟沙星保留时间（ｍｉｎ）２９．３２８３０．５０３３２．８６４３４．５３６３８．６４１４５．２１２４７．２８１５７．１０６５８．７５４

图１喹诺酮类药物分离色谱图１００．００８０．００６０．００４０．００２０．０００．０００．００５．００１０．００１５．００２０．００２５．００３０．００３５．００４０．００４５．００５０．００５５．００６０．００

氧－２９．３２８诺－３０．５０３培－３２．８６４环－３４．５３６洛－３８．６４１达－４５．