第３１卷第２期　

２０１２年３月　浙江海洋学院学报（自然科学版）　

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｏｃｅａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）　Ｖｏ１．３１　Ｎｏ．２　Ｍａｒ．．２０１２　

文章编号：１００８—８３０ｘ（２０１２）０２—０１４７—０６　

１　２种中草药抑茵作用研究　

唐艳，张宾，霍健聪，邓尚贵　

（浙江海洋学院食品与药学学院，浙江舟山３１６０００）　

摘要：筛选了乌梅、金银花、蒲公英、紫草、牡丹皮等１２种可用于食品的中草药，采用水提或醇提法制备中药提取液，　以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌这４种常见食源性致病菌为供试菌，采用牛津杯法进行体外抑菌实　验。结果表明：艾叶、牡丹皮以及乌梅对４种供试菌均有较强的抑制作用，采用正交试验对上述３种中草药进行复配，分析得　出最佳配比为乌梅：艾叶：牡丹皮＝８：１：１，在最佳配比条件下，复配抑菌剂对４种受试菌的最低抑菌浓度分别为７．８１　ｍｇ／ｍＬ、　３．９１　ｍｇ／ｍＬ、１５．６２　ｍｇ／ｍＬ、７．８１　ｍｇ／ｍＬ。扫描电镜的结果表明：中草药复配抑菌剂能够破坏大肠埃希氏菌细胞结构，导致细胞　内容物外泄，细胞死亡。　关键词：致病菌；抑菌活性；复配；最低抑菌浓度；抑菌机理　中图分类号：Ｒ２８５．５　文献标识码：Ａ　

Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｅｆｉｅｃｔ　ｏｆ　Ｔｗｅｌｖｅ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈｅｒｂａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　

ＴＡＮＧ　Ｙａｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｂｉｎ，ＨＵＯ　Ｊｉａｎ－ｃｏｎｇ，ｅｔ　ａｌ　

（Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｙ　ｏｆ　Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｏｃｅａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｏｕｓｈａｎ　３　１６０００，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：１　２　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｈｅｒｂａｌ　ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ　ｉｎ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍｅｄｉａ　ａｇａｉｎｓｔ　

ｔｈｅ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ．Ｄｉｆ＿　

ｆｅｒｅｎｔ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｓｏｌｖｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ（ｗａｔｅｒ　ａｎｄ　ｅｔｈａｎｏ１）ａｎｄ　ｔｈｅｓｅ　ｈｅｒｂ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　

ａｃｔｉｖｉｔｙ（ＡＢＡ）ｔｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ｏｘｆｏｒｄ　ｃｕｐ　ｔｅｓｔ．Ｔｈｅ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｆｏｌｉｕｍ　ａｒｔｅｍｉｓｉａｅ，Ｐａｅｏｎｏｌ　ａｎｄ　

Ｆｒｕｃｔｕｓ　ｍｕｍｅ　ｗｅｒｅ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ．Ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｏ￣ｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｔｏ　ｃｏｍｂｉｎｅ　ｔｈｅ　ａｂｏｖｅ　ｔｈｒｅｅ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　

ｈｅｒｂａｌ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｉｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｗｈｅｎ　Ｆ　ｍｕｍ．ｅ：　ａｒｔｅｍｉｓｉａｅ：Ｐａｅｏｎｏｌ　ｗｅｒｅ　８：１：１，ｔｈｅ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　

ｗａｓ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ．Ｔｈｅ　ＭＩＣ　ｏｆ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｈｅｒｂｓ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｔｏ　４　ｋｉｎｄ　ｏｆ　ｔｅｓｔｅｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｗｅｒｅ　７．８１　ｍｇ／ｍＬ．３．９１　ｍｇ／　

ｍＬ，１５．６２　ｍｇ／ｍＬ，７．８１　ｍｇ／ｍＬ．Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｕｎｄｅｒ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　一　

ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｅｓｔｒｏｙｅｄ　ｂｙ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｈｅｒｂ　ｅｘｔｒａｃｔｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｗａｌｌ　ｗｅｒｅ　ｍｅｌｔｅｄ，　

ｗｈｉｃｈ　ｌｅａｄｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｄｅａｔｈ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ；ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ；ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ；ｍｉｎｉｍｕｍ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　

ｆＭＩＣ）；Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　

收稿日期：　基金项目：　

作者简介：　通讯作者：　２０１　１—１２—２Ｏ　国家国际合作项目（２０１０ＤＦＢ３４２２０）；国家自然科学基金项目（３１０７１６２８）；浙江省优先主题重点项目（２０１１Ｃ１３０２７—２１；浙江省　大学生新苗人才计划项目（２０１０Ｒ４１１０４１）　唐艳（１９８６一），女，四川中江人，硕士研究生，研究方向：海洋生物资源开发与利用．Ｅ－ｍａｉｌ：ｔｙ８５８８＠１６３　ｍ　邓尚贵（１９６６一），男，教授，博士生导师．Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｅｎｇｓｈａｎｇｇｕｉ＠１６３．

ｃｏｎ　浙江海洋学院学报（自然科学版）　第３１卷　

微生物是导致水产品腐败变质的主要原因之一，从鱼类生存环境到加工各途径均可发生细菌感染，我　

国每年由微生物超标而引起的水产品出口损失高达数百万美元。长久以来，我国水产品加工企业对多种致　

病性微生物的控制手段主要为低温冷冻，但由于绝大多数企业产品生产流通等过程尚不能实现冷链的无　

缝对接，因而使用化学防腐剂成为部分企业的主要手段。随着人们对食品安全重视程度不断提高，传统化　

学防腐剂的使用受到越来越严格的限制。因此，开发天然、高效、无毒的天然防腐剂成为今后防腐剂的主要　

发展方向。　

中草药是我国独有的天然植物资源，资源保有量大，价格低廉。诸多研究表明：迷迭香、牛至、丁香等对　

大肠杆菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ２５９２２）、沙门氏菌Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（ＡＴＣＣ１４０２８）、李斯特菌Ｌｉｓｔｅｒ　及金黄色葡　

萄球菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　０“ｒｅｕｓ（ＡＴｃｃ２５９２５）等多种致病性微生物均有较好的抑制功效　。同化学防腐剂相　

比，中草药中所含有的抗菌物质具有不易产生耐药性、毒副作用小、安全性高等优点。以我国特有中草药为　

原料开发天然防腐剂成为既能实现低值中药材的高值化，也符合防腐剂的发展方向。基于上述状况，本研　

究以我国１２种常见中草药进行筛选，研究一种复配型、抑菌谱广的天然防腐剂，在提高水产品质量安全方　

面ｉ　行有益探索。　

１材料与方法　

１．１材料　

１．１．１实验菌株　

大肠埃希氏菌，金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ　ｂｔｉｌｉｓ　ｆＡＴＣＣ１０７７４１，以上菌种均　

购于浙江省疾控中心。　

１．１．２实验药物和试剂　

实验用黄芩、蒲公英、牡丹皮、马齿苋、鱼腥草、连翘、艾叶、金银花、蛇床子、乌梅、夏枯草和紫草１２味　

中药购于浙江舟山定海区存德堂，用中药粉碎机粉碎１００目后置于冰箱保存。　

营养琼脂培养基等培养基购于国药集团上海化学试剂有限公司　

１．１－３实验仪器　

Ｓ－３４００Ｎ扫描电子显微镜，日本ＨＩＴＡＣＨＩ公司；ＥＹＥＬＡ　Ｎ一１００ＩＳ旋转蒸发仪，日本东京理化；ＳＰＸ型　

智能生化培养箱，上海埃朗仪器有限公司；ＨＹＧ—Ａ全温摇瓶柜，上海博迅实业有限公司；ＳＷ—ＣＪ—ＩＦ型单　

人双面净化工作台，上海一恒科技有限公司；ＹＸＱ—ＬＳ一３０ＳＩＩ型全自动立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实　

业有限公司。　

１．２方法　

１．２．１菌种活化培养『５］　

将菌种接种于营养肉汤液体培养基中，摇床扩大培养到对数期（３７℃，１３０　ｒ／ｍｉｎ），利用麦氏比浊法配　

制成浓度为１０８　ＣＦＵ／ｍＬ的菌悬液。　

１．２．２中草药提取液的制备　

药物水提法　：乌梅５０　ｇ加水５００　ｍＬ，浸泡２　ｈ，强火加热至沸再以文火煎６０　ｍｉｎ，过滤，收集滤液，　

置于４　ｃＣ冰箱保存；残渣加水２５０　ｍＬ浸泡２　ｈ，再煎６０　ｍｉｎ，过滤，合并２次滤液，旋转蒸发至５０　ｍＬ，每　

毫升提取液相当于１　ｇ原药。　

药物醇提法罔：除乌梅外其余中药均采用醇提法。具体方法为：称取中药粉末５０　ｇ，用９５％乙醇浸泡，料液　

比为１：１０，混匀后置于２８℃条件下恒温保存４　ｄ，然后置于摇床２　８℃，１６０　ｄｍｉｎ振荡２４　ｈ后过滤，收集滤液；　

滤渣仍用９５％乙醇浸泡，料液比为１：５，２８℃条件下恒温保存２　ｄ后置于摇床２８℃，１６０　ｒ／ｍｉｎ振荡２４　ｈ后过　

滤，收集滤液，合并２次滤液，旋转蒸发浓缩至５０　ｍＬ，，每毫升提取液相当于１　ｇ原药。　

１．２－３抑菌中草药的筛选　

采用杯碟法测定中草药提取物的抑菌活性　。在培养皿中倒人营养琼脂培养基，待凝固后，吸取浓度　

为ｉ０ｓ　ＣＦＵ／ｍＬ的菌悬液０．１　ｍＬ在平板上均匀涂布，在其上等距离放３个无菌牛津杯，

在每个牛津杯中加　第２期　唐艳等：１２种中草药抑菌作用研究　１４９　

人中药提取液２００　Ｌ，用无水乙醇作为对照，每种中药做３次平行试验。３７　ｏ【二恒温培养ｌ８～２４　ｈ，测量并记　

录抑菌圈直径。选取抑菌活性最好的几种中草药进行复配研究。　

１．２－４最低抑菌浓度（ｔｈｅ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，ＭＩＣ）的测定㈣　

采用试管倍半稀释法进行最低抑菌浓度的测定。将浓度为１０ｓ　ＣＦＵ／ｍＬ的菌悬液用营养肉汤培养基１：　

１００稀释。取１０支无菌试管，除第１管加１　ｍＬ营养肉汤外，其余各管加１　ｍＬ营养肉汤，在第１支试管内　

加入１　ｍＬ中药提取液，混匀后吸取１　ｍＬ至第２管，如此连续倍比稀释至第１１管，并从第１１管吸取１　

ｍＬ弃去。第１２管为生长对照。３７℃恒温培养２４　ｈ，观察结果，以完全抑制待测菌生长的最低药物浓度作　

为最低抑菌浓度。　

１．２．５扫描电镜观察【１１　】　

将受试菌接种到液体培养基于摇床培养（３７　ｃｌＣ，１３０　ｒ，ｍｉｎ）培养１０　ｈ，取培养液６　０００　ｒ／ｍｉｎ离心８　ｍｉｎ，　

弃去上清液，沉淀用磷酸缓冲液清洗３次，将沉淀加人到中药提取液含量为７．８１２　５　ｍｇ／ｍＬ的药液中，是　

每毫升药液含菌体１０８个，于摇床中培养（３７℃，１３０　ｒ／ｍｉｎ），分别于４　ｈ、８　ｈ取样，离心弃上清液，沉淀用磷　

酸缓冲液清洗３次，用２．５％戊二醛固定，经系列乙醇、叔丁醇梯度脱水、ＣＯ：超临界干燥、镀膜、喷金，置于　

扫描电镜（Ｓ－３４００Ｎ）下观察，正常受试菌培养１０　ｈ后同上制备作为对照。　

２结果　

２．１抑菌中草药的筛选　

采用牛津杯法对１２种中药进行抑菌活性的测定发现，所选择的１２种中草药对大肠杆菌、金黄色葡萄　球菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌均有一定的抑制效果，对大肠杆菌而言，抑制效果从高到低依次是：金银　

花＞乌梅＞艾叶＞牡丹皮＞马齿苋＞鱼腥草；对金黄色葡萄球菌而言，抑制效果从高到低依次是：艾叶＞牡丹　

皮＞黄芩＞金银花＞连翘＞乌梅；对沙门氏菌而言，抑制效果从高到低依次是：艾Ｄｒ＞乌梅＞牡丹皮＞马齿苋；对　

枯草芽孢杆菌而言，抑制效果从高到低依次是：乌梅＞艾叶＞牡丹皮＞马齿苋＞金银花。由此可见，艾叶、牡丹　

皮、乌梅对４种受试菌的的抑制作用都比较好，其抑菌圈直径均大于２０　ｍｍ；从表１中还可以看出，艾叶和　

乌梅对革兰氏阴性菌的抑制活性大于革兰氏阳性菌，而牡丹皮则对革兰氏阳性菌有更好的抑制效果。故选　

取艾叶、牡丹皮、乌梅进行正交试验，确定最佳复配比例，并测定其最低抑菌浓度。　

表１　１２种中草药提取液的抑菌圈（ｍｍ）　

Ｔａｂ．１　Ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｚｏｎｅ　ｏｆ　１２　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｈｅｒｂｓ　ｅｘｔｒａｃｔｉ０ｎｓ（ｍｍ）　

２．２中草药复配抑菌剂的优化【１３州　

选用Ｌ９（３４）ｊＥ交实验法对筛选出来的３种中草药进行复配。由于乌梅的抑菌活性高，而且是一种药食　

同源的中药，故在复配过程中将其作为主要原料，所占比例最大；艾叶是艾草的叶子，我国民间有习俗在清　

明前后吃的青饼即位艾叶所制。