流动相的离子强度对RP 作者：刘浩 王红武 丁建英 仇仕林 【关键词】 ,,RP 摘要： 在反相高效液相色谱(RPHPLC)过程中，流动相的离子强度可显著影响可解离的化合物如抗生素的色谱峰形，原因在于流动相的离子强度较低时，色谱填料的固定相易于过载，使离子化的化合物的色谱峰形呈典型的过载特征——峰形接近直角三角形。随着进样量的增加，色谱区带中高浓度的前半部的保留时间减少，但色谱区带均在同一时刻结束，色谱峰的拖尾因子及峰宽均显著增加，同时被测物与有关物质间的分离也随之变差。选择合适的缓冲盐并适当地增加流动相的离子强度即可显著改善抗生素的色谱峰形，色谱峰的拖尾因子及峰宽均随之降低，同时被测物与有关物质间也更加易于分离。 关键词： RPHPLC； 抗生素； 色谱峰形； 流动相； 离子强度 Influence of the ionic strength of mobile phase on peak shape of antibiotics in RPHPLC ABSTRACT The ionic strength of mobile phase can significantly affect the peak shape of ionogenic compounds such as antibiotics in reversedphase high performance liquid chromatography (RPHPLC). The influence may be attributed to overloading of ionogenic analytes in lower ionic strength mobile phase. In such phase, peak becomes increasingly rightangled triangle in shape with increasing sample load together with increasing peak width and tailing. The retention time of the highconcentration front decreases with increasing sample load, while the end of the peak tail has a constant retention time, equal to the symmetrical analytical peak. Due to considerably worse peak shapes, poorer resolution between the main component and its related substances might be observed. With the optimal buffer and the increase of ionic strength, significant improvement in peak shape of antibiotics could be achieved and consequently a decrease in the tailing factor, an increase in the apparent column efficiency as well as an efficient resolution were obtained. KEY WORDS RPHPLC; Antibiotics; Peak shape; Mobile phase; Ionic strength 据统计，约80%的药物含有碱性官能团，故碱性化合物的反相高效液相色谱(RPHPLC)行为在色谱学界始终是一个引人注目的研究课题，而具有不同pKa值的碱性药物的RPHPLC分离在药学界的重要性正日益被关注［1］。然而，由于碱性化合物的保留可随着流动相pH值的不同而产生显著的变化，因而它们的RPHPLC分离通常具有一定的难度。在某些pH范围内，碱性化合物的色谱峰拖尾，表观柱效(理论板数，n)较低，其原因可能包括色谱柱的过载、碱性化合物与填料表面残余硅醇基的相互作用以及较慢的吸附解吸附动力学等。绝大多数抗生素同时含有碱性和酸性基团，多为亲水性的两性化合物，故其RPHPLC行为远较通常的碱性化合物更为复杂。我们在应用现行各国药典［2～4］进行抗生素RPHPLC分析时发现，有些抗生素的色谱峰形异常——峰形展宽并接近直角三角形，色谱峰的拖尾因子及峰宽均较大，有时甚至影响到被测物与有关物质间的分离。囿于目前的填料制造水平，以硅胶为基质的反相键合相填料的表面实际上是不均匀的，固定相中不可避免地含有少量高能量位点(sites)，这些高能量位点易为可解离的(甚至中性的)化合物所过载(overloading)［5，6］。此外，解离的化合物在固定相表面的相互排斥作用以及较难渗透进入疏水性的固定相中也是可能的原因［7］。众多实验结果已经证实，在线性色谱(linear chromatography)领域，采用RPHPLC分离可解离的(尤其是碱性的)化合物时色谱柱易于过载，甚至低达10ng(相当于10-6，进样10μl)的碱性化合物也可使常规色谱柱(150mm×46mm)的表观柱效明显降低；减少进样量则可改善色谱峰形并使表观柱效显著增加；过载效应可随着流动相的离子强度(c)的增加而逐渐减弱［8～12］。本课题选取了几个具有代表性的抗生素品种，初步研究了流动相的离子强度对RPHPLC中抗生素色谱峰形的影响。 1 仪器与试药 美国Agilent 1100型HPLC仪。色谱柱：头孢呋辛为美国Discovery C18(250mm×46mm，5μm)，头孢哌酮和青霉素G为英国Hypersil BDS C18(250mm×40mm，5μm)，克林霉素为日本TSK GEL ODS100S(150mm×46mm，5μm)。头孢呋辛钠、头孢哌酮钠、头孢哌酮S异构体、头孢哌酮降解物B、盐酸克林霉素和青霉素G钾对照品均由中国药品生物制品检定所提供。乙酸钠、乙酸、氯化钠、氢氧化锂、氢氧化钾、氨水、甲酸钠、甲酸、三乙胺、磷酸二氢钾、磷酸二氢铵、磷酸和高氯酸钠均为分析纯，乙腈和甲醇均为HPLC级，水为蒸馏水。应用PeakMaster 5.1软件(Charles大学)计算流动相的离子强度。 2 色谱条件和测定方法 流动相的组成以及供试品液的浓度见结果与讨论；检测波长：头孢呋辛和头孢哌酮为254nm，克林霉素为214nm，青霉素G为220nm；柱温30℃。流速：头孢呋辛为15ml/min，头孢哌酮为12ml/min，克林霉素和青霉素G为10ml/min。进样体积：头孢呋辛为20μl，头孢哌酮、克林霉素和青霉素G为10μl。以流动相作头孢呋辛钠、头孢哌酮钠和盐酸克林霉素的溶剂，以水作青霉素G钾的溶剂。 3 结果与讨论 已知在低pH值的流动相中，以所谓“B型”高纯度硅胶为基质的反相键合相填料的表面几乎不存在离子化的硅醇基，这使得残余硅醇基对被测物的保留和过载行为的影响极小［10，11］，故本课题主要采用这类金属残留量极低、酸性硅醇基含量最少的惰性填料——Discovery C18、Hypersil BDS C18和TSK GEL ODS100S。 3.1 头孢呋辛中国药典(ChP)［2a］测定头孢呋辛钠中头孢呋辛含量的RPHPLC系统是参考美国药典(USP)和英国药典(BP)［3a，4a］制订的，主要区别在于ChP选用C18柱代替USP规定的己基硅烷键合硅胶(C6)柱，而流动相则均为乙腈∶pH34乙酸盐缓冲液(含5mmol/L乙酸钠和01mol/L乙酸)(1∶10)，头孢呋辛(羧基的pKa值为25［13］)在流动相中大部分呈解离状态并荷负电。由于ChP规定采用较大的进样量(05mg/ml，约11mmol/L，20μl)，使头孢呋辛峰具有典型的过载特征［5～12，14］——峰形接近直角三角形。随着进样量的增加，色谱区带中高浓度(C)的前半部的保留时间(tR)相应减少，但色谱区带均在同一时刻结束(Fig.1A，Tab.1)。这种色谱峰形在色谱学界通常称之为过载拖尾(overload tailing)或非线性拖尾(nonlinear tailing)。过载使头孢呋辛峰的拖尾因子(T)和峰宽均显著增加，头孢呋辛与有关物质间的分离也相应变差。另选用其他C18柱(Kromasil C18、Zorbax C18、Inertsil ODS3、Hypersil BDS C18、TSK GEL ODS100S、Shimpack CLCODS和LiChrospher 100 RP18e)、C8柱(Kromasil C8、Inertsil C83、Hypersil BDS C8、Shimpack CLCC8、TSK GEL C8和Discovery C8)和C4柱(SinoChrom C4)实验，结果也如此。如选用C6柱则可得最为对称的色谱峰形［15］，且头孢呋辛峰无过载特征(Fig.1B)。国内另有研究表明，头孢呋辛的峰形与填料的品牌也即填料的制造工艺有关，选用某些品牌的填料如Spherisorb C18可得较为对称的峰形［16］，在我们的实验中也得到证实。由此可见，虽然所用流动相的缓冲容量较低(乙酸的pKa值约为47［17a］)，但头孢呋辛在大多数类型的色谱柱上易于过载并非由于缓冲液过载(buffer overload)所致，而可能源于这类色谱柱对离子化的化合物的饱和容量相对较低。 Fig.1 （略） 最近的研究结果［7～12，18～27］显示，应用RPHPLC分离可解离的化合物时，流动相中添加缓冲盐并非仅仅用于稳定流动相的pH值，缓冲盐、甚至简单的中性盐的反离子还可与离子化的被测物通过相互间的缔合作用形成疏水性较强的中性离子对复合物；在低离子强度的缓冲液中，吸附在固定相表面的离子化的被测物分子的极性基团相互之间存在静电排斥效应，这使得色谱柱的饱和容量显著降低；随着缓冲液浓度(离子强度)的增加，中性离子对复合物的浓度相应增加，固定相表面离子化的吸附物之间的相互排斥作用随之减弱，导致色谱柱的饱和容量、尤其是填料上的低能量位点(与溶质和键合相的烷基链之间的相互扩散作用有关)的饱和容量以及平衡常数增加；盐一类的流动相添加剂可破坏离子化的被测物在流动相中的溶剂化去溶剂化平衡，产生所谓的促溶效应(chaotropic effect)，被测物与盐相互作用，离子化的被测物相互间的排斥作用减弱，从而显著地影响被测物在固定相上的吸附行为；在制备色谱系统中或被测物浓度较高时，流动相中应含有足量的缓冲盐以改善色谱峰形和分离效果。根据文献［8～12，18～27］，在流动相中添加中性盐如氯化钠或增加缓冲液的浓度(均使离子强度增加)后，头孢呋辛的峰形显著改善，拖尾因子降低，表观柱效增加，其保留时间受进样量的影响变小，且缓冲液的浓度越高，效果越明显。有研究表明，色谱柱的饱和容量可随缓冲盐的单价阳离子(如Na 、K 、Cs )直径的增加而降低［18］，故分别以NH 4、K 、Li 代替Na 进行了实验。选用Na ，色谱柱的饱和容量相对较高。流动相中如含10%乙腈，则乙酸的pKa值可由47增至49［28～30］；流动相的表观pH值通常可随着乙腈浓度的增加而相应增加，且表观pH值的变化与缓冲盐的种类、浓度以及最初的pH值等均相关［28，29］。显然，现行药典的流动相的缓冲容量较低，流动相中的乙酸只有极少量以解离的形式存在，如欲增加缓冲液的浓度，则缓冲液中需添加高浓度的乙酸，这使得乙酸可能作为强洗脱剂成分，改变色谱系统的选择性。因此，缓冲盐改用与乙酸性质类似但更为适宜的甲酸盐(pKa值约为37［17b］)，同时流动相进一步优化为乙腈∶pH34甲酸盐缓冲液(含80mmol/L甲酸钠和014mol/L甲酸)(1∶9)，则可得较好的色谱峰形(Fig.1C)。另用其他C18柱(Kromasil C18、Hypersil BDS C18和TSK GEL ODS100S)实验，亦可得显著改善的色谱峰形。众所周知，保留值(如容量因子k)反映了被测物在固定相和流动相中的量之比，故过载行为对保留值较大的组分更易于发生［11］。实验结果也证实，随着流动相中乙腈浓度的增加，头孢呋辛的保留时间减少，色谱峰的对称性进一步改善(乙腈浓度为15%时，理论板数不增反降则是由于保留时间较少时，表观柱效受柱前死体积的影响相对较大所致)。 3.2 头孢哌酮ChP［2b］测定头孢哌酮钠中头孢哌酮含量的RPHPLC系统是参考USP［3b］制订的，ChP和USP的流动相均为乙腈∶pH44乙酸盐缓冲液(含12mmol/L三乙胺和4mmol/L乙酸)(12∶88)；BP［4b］的流动相为乙腈∶pH44乙酸盐缓冲液(含25mmol/L三乙胺和6mmol/L乙酸)(11∶89)。ChP采用较大的进样量(05mg/ml，约07mmol/L，10μl)，头孢哌酮及其S异构体的色谱峰均具