生理学报 Acta Physiologica Sinica, August 25, 2006, 58 (4): 370-376http://www.actaps.com.cn370

Received 2006-03-30 Accepted 2006-06-02This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 30400251).*

Corresponding author. Tel: +86-10-62179164; Fax: +86-10-62173457; E-mail: jmchun@163bj.com人骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中差异表达基因的筛选

刘美玲，石心泉，周万灏，刘洪文，李 东，贾孟春*

国家人口计划生育委员会科学技术研究所，北京 100081

摘 要：为了探讨人骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)向成骨细胞分化过程中差异表达的基因，本实验采用体外培养人BMSCs，诱导向成骨细胞分化。分别选取培养12和21 d的细胞作为驱动方(driver)和实验方(tester)，进行抑制消减杂交，构建cDNA消减文库，将挑选出的阳性克隆与GenBank人基因库中已公布的核酸序列进行同源性比较分析。结果表明，从培养21 d的BMSCs中，筛查出5个差异基因，与人基因库中已知基因的同源性分别达到90%以上。有兴趣的是，核心蛋白聚糖和Bax inhibitor 1在培养21 d的BMSCs中差异表达。RT-PCR检测显示，核心蛋白聚糖基因在培养21d的细胞中高表达，而在12 d的细胞中未检测到表达；Bax inhibitor 1基因在培养21 d细胞中的表达明显高于12 d的细胞。

关键词：骨髓基质细胞；成骨细胞；核心蛋白聚糖；基因中图分类号：R329

Screening differentially expressed genes in human bone marrow stromal cells at

defined stage of differentiation

LIU Mei-Ling, SHI Xin-Quan, ZHOU Wan-Hao, LIU Hong-Wen, LI Dong, JIA Meng-Chun*National Population Research Institute for Family Planning, Beijing 100081, China.

Abstract: To screen differentially expressed genes involved in osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells (BMSCs)at defined stages, subtractive cDNA library was established by means of suppression subtractive hybridization. The BMSCs culturedfor 12 and 21 d were used as driver and tester, respectively. A subtract library was successfully constructed and five positive cloneswere selected from the library. Sequencing analysis and homology comparison showed that the five clones differentially expressed inBMSCs cultured for 21 d were at least 90% homologous with the known genes in human GenBank. It was interestingly found that theosteogenic BMSCs cultured for 21 d differentially expressed decorin and Bax inhibitor 1. RT-PCR was performed to confirm thedifferentially expressed genes. The results showed that the expression of Bax inhibitor 1 was significantly higher in the cells of 21-daythan that of 12-day, while the expression of decorin was only detected in the cells of 21-day.

Key words: bone marrow stromal cells; osteoblast; decorin; gene

正常骨量的维持需要骨祖细胞不断提供足够的

成骨细胞，而正常骨转换中所需要的成骨细胞来源

于骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)。BMSCs是骨髓基质的一种间充质细胞，它能产生骨

祖细胞系。BMSCs具有多向分化潜能，在一定的

诱导条件下可向脂肪细胞、肌细胞、软骨细胞，甚

至神经细胞等分化[1,2]。定向分化的骨祖细胞首先增殖并分化为前成骨细胞，同时表达I型胶原和碱性

磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)。I型胶原的合成

在细胞增殖期占主导地位，并与细胞的进一步分化有很大的关系。随后前成骨细胞分化为早期的成骨

细胞并表达骨桥蛋白(osteopontin, OPN)，同时具有

了骨基质形成的能力。最终，分化成熟的成骨细胞

开始骨钙素(osteocalcin, OC)的表达，并进一步分化

371刘美玲等：人骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中差异表达基因的筛选

为骨矿化基质内的骨细胞、骨衬细胞，或者发生凋亡。OC是一个维生素K依赖、维生素D诱导的钙

结合基质蛋白，是成骨细胞成熟的标志。OC的表

达在矿化期开始，并逐渐达到高峰。在基质成熟

期，ALP的活性进一步升高，而胶原合成则急剧下

降。此外，其它蛋白和一些细胞因子也可在分化的

不同阶段表达，如骨粘连蛋白(osteonectin, ON)和TGF-β1等在基质成熟期达到最高表达，而骨唾液

酸蛋白(bone sialoprotein, BSP)则要早于OC，在成

熟晚期即开始表达。

BMSCs来源于骨髓，取材方便，具有良好的

分化和增殖能力，目前被认为是较理想的骨组织工

程种子细胞。体外培养BMSCs，利用地塞米松，维生素C和甘油磷酸钠可以诱导其分化发育为成骨

细胞。近年来国内外的研究者已对BMSCs向成骨细

胞分化做了大量研究[3-9]，但是国内对于调节BMSCs

分化的基因的研究甚少。

如何保证BMSCs能在特定的时间内定向扩增到

临床治疗所需的数量，同时保证细胞不老化，并避免致瘤性的产生是目前亟待解决的问题。因此，研

究BMSCs向成骨细胞分化相关的调控基因具有重要

的现实和深远意义。

本研究取人BMSCs进行体外定向诱导培养，分

别提取分化到早期的成骨细胞(12d)和成熟的成骨

细胞(21d)的总RNA，利用抑制消减杂交技术(sup-

pression subtractive hybridization, SSH)，筛查这两个阶段差异表达的基因，探讨BMSCs分化通路的分

子生物学机制，为其作为组织工程种子细胞的研究

奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 在患者知情同意的情况下，获得外科

手术残留的成年人新鲜肋骨组织(约1cm3)。根据临

床检查和生化检测等手段，排除对骨代谢影响的疾

病，如甲状腺疾病、糖尿病以及其他已知原因的骨

代谢疾病。TRIzol RNA提取试剂购自Invitrogen公司；SMART PCR cDNA合成试剂盒/PCR-Select

cDNA Subtraction试剂盒、Advantage 2 PCR和PCR-

Select Differential Screening试剂盒购自Clontech公

司；QIA quick PCR纯化试剂盒购自QIAGEN公司；

Taq DNA聚合酶、pGM-T Easy载体和DH5α菌株

购自天根公司；引物由北京三博远志公司合成；Hybond N＋ 尼龙膜购自Pharmacia公司；[α-32P]-dCTP购自北京亚辉公司。磷屏影像系统Cyclone购自PerkinElmer Lifesciences (PELS) 公司。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs培养和成骨细胞鉴定 α-MEM/

free细胞培养液成分：α-MEM粉末1包加2.2 g

NaHCO3定容于1 000 ml ddH2O中，过滤除菌。α-

MEM/all细胞培养液成分：在α-MEM/free培养液中加入10 mmol/L β-甘油磷酸钠，15% 胎牛血清，

1×10-8 mol/L地塞米松，50 μg/ml维生素C，100

IU/ml青链霉素。细胞培养：将外科手术残留的成

年人新鲜肋骨组织样本(约1cm3)用PBS洗，再用α-

MEM/free培养液冲出骨髓细胞，室温1 000r/min离

心10 min，弃上清，沉淀加入10 ml α-MEM/all培养液重悬。将重悬细胞液缓慢倒入10 ml Ficoll-

PaqueTMPLUS液上，室温下2 000r/min离心20 min，

取中间白色云雾状细胞层，加10 ml PBS，室温

1 000r/min离心10 min。沉淀细胞用PBS洗两次，

加入2 ml α-MEM/all培养液重悬细胞，取10 μl镜

下计数后接种于培养瓶中，于37℃、5% CO2孵箱中培养。24h半量换液，之后2~3d换液一次。碱

性磷酸酶染色(Gomori钙钴法)鉴定成骨细胞：将生

长有细胞的盖片PBS冲洗后冷丙酮固定10min；双

蒸水冲洗数次，加入孵育液，37℃、4h；自来

水冲洗，在2%硝酸钴中浸3~5 min；蒸馏水洗数

次，在1%硫化铵中浸2 min；自来水冲洗，自然干

燥后封片。1.2.2 总RNA的提取 按照TRIzol试剂的说明，

分别提取上述培养了12和21 d的细胞总RNA，经

纯化后溶于适量灭菌DEPC水中，紫外分光光度计

定量，并各取5 μl电泳检测完整性。

1.2.3 单链cDNA (sscDNA)和双链cDNA (dscDNA)

的合成 按照SMART PCR cDNA合成试剂盒的说明，分别将培养了12和21 d的细胞总RNA反转

录成sscDNA。以稀释的sscDNA为模板，利用PCR

方法制备dscDNA，反应条件为95℃预变性1 min，

然后95℃ 15 s，65℃ 30 s，68℃ 6 min，进行21

个循环。合成sscDNA和dscDNA的引物均由

SMART PCR cDNA合成试剂盒提供。1.2.4 SSH 所得dscDNA纯化后，用限制性核

酸内切酶RsaI 37℃酶切约2 h，电泳检测酶切效

果，纯化后分别进行正向消减和反向消减。正向消

减的基本过程如下：以酶切所得的培养12 d的细胞

dscDNA片段为驱动方(driver)、培养21 d的细胞