瞬时表达
本实验室一般采用瞬时表达的方法研究两个基因是否有相互作用（如转录因子是否能够诱导相应基因的表达）。

1.培养室中种植小叶烟草（Nicotiana Ben？，俗称本氏烟草？），一般约一周后萌发，约一个半月后可以用于瞬时表达实验。

注意：小叶烟草的生长状态非常重要，直接决定了烟草瞬时表达实验的效果。

需要选取浓绿、厚实的叶片进行实验。

2.将需要检测的质粒分别转化农杆菌GV3101（庆大霉素抗性，50ug/ml；菌株不同，所对应的抗性也不同），在双抗板上生长两天后可以看到农杆菌菌落。

挑选单克隆，转接至0.5-2ml加有合适浓度双抗的LB液体培养基（离心管或者试管），28℃培养过夜，菌液PCR鉴定；转接生长良好的菌液至新的双抗LB液体培养基（试管或者锥形瓶），培养至OD600约0.6-0.8左右。

3.配制烟草瞬时表达的注射缓冲液，配方如下：
0.5M MES 1ml
20mM Na3PO4 1ml
D-葡萄糖50mg
1M 乙酰丁香酮1ul
水（一般情况下最先加入）补齐至10ml
注意：MES与Na3PO4溶液容易染菌，染菌后需要重新配制母液。

乙酰丁香酮需要用N-N-二甲基甲酰胺溶解后分装，尽可能避免反复冻融。

注射缓冲液需要现配现用。

4.将农杆菌菌液用EP管分装后3000rpm离心10分钟（4℃或者室温均可），去上清（尽可能清除干净）；利用注射缓冲液重悬后3000rpm离心10分钟，去上清，重复共两次。

注射缓冲液重悬。

5.利用步骤4中的农杆菌重悬液，配制不同的农杆菌组合，使农杆菌菌液的最终浓度达到OD600 0.1-0.5之间。

利用一次性注射器，将农杆菌菌液注射至小叶烟草叶肉，吸水纸吸去叶片表面多余的菌液，做好标记。

注意：（1）若需要观测蛋白的亚细胞定位，农杆菌菌液的浓度OD600在0.1左右会更好，浓度过高会导致背景信号强或者假象；检测样本与对照间的浓度要保持统一，比如35S::TF-A+ProB::GUS组合与ProB::GUS进行比较，两种注射液中ProB::GUS的浓度要相同；农杆菌OD600过高会导致叶片萎蔫死亡；（2）由于农杆菌菌液对叶片造成伤害，所以注射后一天内，叶片会较为萎蔫，再经过一段时间后会逐渐恢复正常。

若叶片内残留的菌液过多，会导致叶片完全萎蔫，所以吸去多余菌液是非常必要的。

6.两天后取小叶烟草叶片，撕下注射部位的表皮，观察荧光的亚细胞定位；或者撕去注射部位的表皮，进行GUS染色或者其他蛋白水平分析。

注意：表皮容易观察，所以荧光观察时选取表皮最为合适；而表皮较为致密，导致GUS染色步骤中的固定液与染色液难以渗透，所以一般情况下撕去表皮，留下叶肉细胞进行检测。