© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net应用与环境生物学报 2003,9(6):639～641 ChinJApplEnvironBiol=ISSN10062687X 2003212225
多环芳烃降解菌的获得及应用3
韩清鹏33 方 秦利峰 王平(浙江大学生物医学工程系 杭州 310027)摘 要 运用双相(水-硅油)系统可进行有机物降解菌的筛选.本实验用此法获得了多环芳烃(PAHs)的降解菌,降解菌对PAHs有较好的降解作用.堆肥法处理PAHs中接入筛选到的降解菌可以大大加强降解效果.堆肥过程中堆温升高很快,对一些PAHs如荧蒽、芘、苯并[a]芘等可以彻底清除,对更多环的PAHs也可降到很低的浓度.图1表3参4
关键词 多环芳烃;降解;水-硅油系统CLC X172
PAHs2DEGRADINGMICROORGANISMSANDTHEIRAPPLICATION3
HANQingpeng33,FANGFang,QINLifeng&WANGPing(BiomedicalCollege,ZhejiangUniversity,Hangzhou 310027,China)
Abstract Thebiphasicaqueous-organicsystem(water-siliconoilsystem)isusefultoselectthemicroorganismsdegradingPAHs.ThedegradingmicroorganismswereobtainedintheexperimentandwereinoculatedincomposttodegradePAHs.Thedegradingeffectwasevident.Whilecompostingtemperatureraisedquickly.SomePAHscouldbedegradedthoroughlybutsomePAHswithmoreringscouldalsobedegradedinafairlylowlevel.Fig1,Tab3,Ref4Keywords PAHs;degrade;biphasicsystem;compostCLC X172
多环芳烃(polycyclicaromatichydrocarbons,简称PAHs)主要来源于煤焦油、杂酚油和石油以及有机质不完全燃烧而产生的污染物.由于它们在环境中的化学稳定性高、水溶性低且长期残留,致癌致畸且有毒,因此解决这类化合物引起的污染问题是非常有意义的.
多环芳烃理化性质不相同,反映出的生物降解性也各不相同.一般说来,多环芳烃的降解性随苯环数量的增加而降低,三环以下的易于降解,四环以上的较难降解[1].
研究多环芳烃这一类难降解有机物的生物降解过程,首要问题是筛选降解菌.只有分离到降解菌后,才能作进一步的理论研究和用于生物修复PAHs的污染.用一种水-硅油双相系统可进行对PAHs类难降解物质的降解菌的富集、筛选[2,3].
把获得的降解菌接入多环芳烃污染的堆肥中可加速多环芳烃的降解.本文研究了用水-硅油双相系统筛选多环芳烃降解菌,并把降解菌用于含有PAHs的污染物中进行堆肥处理.
1 材料与方法1.1 多环芳烃的来源某化工厂的工业废物酸焦油,系有机液体和固体混合物,
其中固体废渣占36.3%(质量分数),酸焦油为1719～19536
mg/kg,其中苯并芘(B[a]P)为3567mg/kg,15种PAHs含量之和为96999mg/kg,占酸焦油总量的9.7%.酸焦油用φ=
1/11的甲苯溶解.
收稿日期:2002210211 接受日期:2002212203
3国家自然科学基金资助项目(No:29577269) SupportedbytheNa2
tionalNaturalScienceFoundationofChina33通讯作者 Correspondingauthor
1.2 水-硅油两相系统组分硅油系高纯度的液体,成分为聚二甲基硅氧烷醇,分子量2000左右,运动粘性系数20×10-2m2/s,密度为0.95,表面张力为20.6×10
-5
N/cm,阶电常数为2.72.
无机盐培养液配方如下(ρ/mgL
-1
):K
2HPO4775,
KH2PO4350,(NH4)2SO4・7H2O100,FeSO4・7H2O1,MnSO4・
H2O1,Na2MoO40.21,CaCl240(培养基1)[3].1.3 富集降解菌的方法在水-硅油系统中富集.每个250mL的三角瓶中加入80
mL的无机盐培养液和20mL的硅油,加入待降解物作为碳源,加入污染物作为菌源,室温30℃下培养,振荡速度为120
r/min.经过一段时间的生长后,可见液体浑浊而且pH下降,取5mL的上述液体加入另外一个装有同样物质的三角瓶,作为对照(CK)[3].
1.4 PAHs降解菌的分离在无机盐固体培养基上涂布菌液.然后喷涂溶有PAHs的乙醚溶液,乙醚很快挥发,PAHs留在培养基上,PAHs的浓度与水-硅油系统富集PAHs降解菌时的PAHs浓度相同.待菌长出后,进一步纯化菌种,保存.
1.5 混合菌在水-硅油系统中对PAHs的降解效果的测定在含有PAHs的水-硅油系统中接入活化的PAHs降解菌,15d后用HPLC色谱仪测定PAHs的残留.
1.6 用堆肥法结合接种降解菌处理多环芳烃中的实验以鸡粪和树叶及土壤为原料堆肥(CN=251).堆肥容器为圆筒形容器(内径20cm,高65cm).由于堆肥体积小,为了© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
避免堆肥堆温上升后热量的散失,外用木屑保温,顶部使用具孔的盖子盖顶,起到保温遮光的作用,同时也可满足通气的要求.往堆肥中加入酸焦油的浓度为280mg/kg,同时接入5%左右的降解菌(液体培养3～5d后)接入堆肥中,监测堆肥温度的变化,在堆肥初期、升温期末、高温期末、降温期末和腐熟期末翻堆、采样,测定水分变化,并将水分含量控制在60%左右.1.7 堆肥样品的提取和浓缩[4]称取1.00g污染样物置于10mL具塞玻璃离心管中.加入2.00g的无水Na2SO4混匀,加入10mL混合溶剂(V二氯甲烷V丙酮=21),放置75～90min,超声提取20min,以2500r/min,离心5min,将上清夜转移至T2D浓缩管,再往离心管中加入8mL混合溶剂,放置60min,超声提取15min,以2500r/min,离心3min,将上清夜与上次提取液合并K2D浓缩管中,用常量、微量Snyder柱浓缩至1.0mL以下(水浴温度69～75℃),用丙酮定溶至1.0mL,过滤,同时进行溶剂空白实验.所有操作均在避光条件下进行.同时称取2.00g的样品,测定样品的含水量.1.8 多环芳烃的测定方法分析仪器为岛津LC100型液相色谱仪,紫外线检测器,波长为254nm,样品分析时间为30min,打印时间为60min,进样过程:B泵水流速为0.1mL/min,A泵甲醇流速为0.4mL/min,进样11min后梯度洗脱40min洗完.标准样品:16种多环芳烃标准储备液.用保留时间和峰高测定PAHs;以PAHs混合标准液为外标,定量计算PAHs的浓度.2 结果与讨论2.1 利用水-硅油系统筛选PAHs降解菌2.1.1 降解菌的富集和分离 在上述水-硅油两相系统中富集得到降解菌.每隔3d测定微生物数目,选用含葡萄糖的培养基培养,获得总菌数.微生物生长见表1.表1 水-硅油系统富集PAHs降解菌不同时间微生物的生长Table1 GrowthofPAHs2degradingmicroorganismsinthebiphasicsystemt/d03691215n/mL-15×1065×1061×1078×1071.5×1081×108 由表1可知,d12菌数达到1.5×108mL-1,微生物生长旺盛.可以进行下一步的分离.在无机盐固体培养基上涂布菌液,然后喷涂溶有PAHs的乙醚溶液.乙醚随后挥发.待菌长出后,进一步纯化分离,得到三株降解菌,一种为霉菌,两种细菌,待鉴定.先编号为S1,S2,S3.前两株为细菌,后一株为霉菌.2.1.2 降解菌降解效果的测定 在含有多环芳烃的水-硅油两相系统中接入降解菌,培养15d后,测定降解效果如表2.由表2可知,从两相系统中筛选得到的降解菌对各种PAHs均有降解,对环较少的PAH降解效果较好,如对萘、苊烯、菲、蒽和芴的降解比较彻底.降解菌对环较多的PAHs,如荧蒽、芘、苯并[a]芘、苯并[ghi]北的降解效果就差一些.运用双相系统在15d内筛选到了PAHs降解菌.与别的方法相比,水-硅油系统提供给微生物一个特殊的有机相环境(PAHs溶解在硅油里面),可以避免PAHs对微生物的抑制,并且提高微生物的代谢功能.在此系统中PAHs的浓度较高(PAHs总浓度为1.45g/L),可以提供充分的碳源和能源,
PAHs是一类理化性质各不相同的物质,因此此降解过程中有共代谢作用和微生物之间的相互作用,在富集中会提高选择的程度.实际应用的菌为混合菌.这与在自然环境中混合菌作用于不同污染物的过程是相似的.
表2 降解菌在水2硅油系统中对PAHs地降解效果Table2 DegradationofPAHsinthebiphasicsystembythemicroorganisms
名称Name
降解菌降解效果Degradationresults
非生物降解率Abioticdeg2radationrate生物降解率Biologicaldeg2radationrate总去除率Totalremov2alrate
萘Naphthalene无No81.781.7
苊烯Acenaphthene3.796.3100
苊+芴Fluerence2.787.189.8
菲Phenanthrene无No92.292.2
蒽Anthracene无No100100
荧蒽FA5.654.359.9
芘Pyrene17.841.359.1
苯并[a]芘B[a]P2.854.657.4
苯并[ghi]北B[ghi]Pe7.630.838.4
3非生物降解率的测定为对照处理,即不接种菌的降解如光解和物理、化学作用 IndicatingCK
2.2 降解菌在堆肥处理多环芳烃的应用2.2.1 接种降解菌处理PAHs的堆肥温度变化 本实验中温度随时间的变化曲线如图1所示.由图1可知,加入降解菌F0d2就开始升温,d4升到30℃以上,d9达到高温峰值58