簿嬲　

重楼总皂苷提取分离及其对人胃癌细胞ＢＧＣ８２３的　抑　制　作　用　吴夏慧　薛　娇　胡文静　禹立霞　钱晓萍　刘宝瑞　（南京大学医学院附属鼓楼医院，江苏南京２１０００８）　

摘　要　目的：初步探索重楼总皂苷的提取分离方法，并通过比较重楼总皂苷与重楼醇提物、重楼皂苷Ｉ对人胃癌细　胞ＢＧＣ８２３生长抑制作用评价重楼总皂苷提取分离工艺和临床应用价值。方法：采用热回流提取法得到重楼醇提物．再经　大孔吸附树脂分离得到重楼总皂苷。采用噻唑蓝染色法（ＭＴＴ法）和集落形成实验。比较重楼总皂苷与重楼醇提物、重楼皂　苷Ｉ对人胃癌ＢＧＣ８２３细胞增殖和集落形成的影响。结果：重楼总皂苷、重楼醇提物、重楼皂苷Ｉ作用于人胃癌ＢＧＣ８２３　细胞４８ｈ的半数抑制浓度（ＩＣ５０）分别为（８．６３＋０．３０）、（２．６１￣０．０３）、（１．９７￣０．Ｏ１）　ｇ／ｍＬ。在３．１３、６．２５、１２．５１ｘｇ／ｍＬ浓度下重楼　醇提物组集落形成抑制率为３０．８４％、５３．２７％、１００％，而重楼总皂苷组在各浓度范围内均无集落形成。结论：重楼总皂苷对　人胃癌ＢＧＣ８２３细胞生长抑制作用显著优于重楼醇提物，稍弱于重楼皂苷Ｉ，但二者ＩＣ５ｏ数值接近且均较低，从而肯定重　楼总皂苷提取分离工艺和临床应用潜能。　关键词　重楼　皂苷ＢＧＣ８２３细胞　细胞增殖　病理学　体外实验　中图分类号Ｒ２８２．７１０．５　文献标识码Ａ　文章编号　１６７２—３９７Ｘ（２０１１）０８—００８４—０３　中药重楼（Ｒｈｉｚｏｍａ　Ｐａｒｉｄｉｓ）为百合科植物云南重楼或七叶　一枝花的干燥根茎，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效，　主治疔疮痈肿、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌扑伤痛、惊风抽搐等症田。　实验室前期研究表明，重楼复方及重楼醇提物对肿瘤生长有良　好的抑制作用１２－３］。同时，国内外大量文献报道重楼皂苷具有抑制　肿瘤细胞增殖、诱导凋亡等作用，其中以重楼皂苷Ｉ抗肿瘤活性　最强．研究最为广泛Ｈ＿ｑ。有效部位是中药研究的一种新的思路，　其既去除了中药及其复方的杂质．又保留了化学成分相近、功效　类似的药效成分群。符合中药多成分、多靶点、多效应的作用特　点，且提取分离工艺相对单体化合物简单，便于研发和临床应　用。鉴于重楼良好的抗肿瘤活性和有效部位研究的优势，本实验　探索重楼抗肿瘤天然有效部位——总皂苷的提取分离方法，并　比较重楼总皂苷与其醇提物、重楼皂苷Ｉ体外直接细胞毒作用，　从而进一步评价重楼总皂苷提取分离工艺和临床应用价值。　１实验材料　１．１　药材重楼．产地四ＪＩＩ，’购自重庆重楼中药饮片厂有限　公司，批号１００４０１；重楼皂苷标准品Ｉ，购自南京泽朗医药科　技有限公司，纯度≥９８％。　１．２主要仪器　Ｒ５０１型旋转蒸发器（上海申顺生物科技有　限公司），Ｏｌｙｍｐｕｓ倒置显微镜（日本ＯＬＹＭＰＵＳ公司），低速　离心机（北京医用离心机厂），ＥＸＬ８００自动酶标仪（美国Ｂｉｏ—　Ｔｅｋ公司），ＣＯ：培养箱（日本ＳＡＮＹＯ公司），超净工作台（苏　州净化设备有限公司）。　１－３主要试剂　ＲＰＭＩ１６４０培养液（美国ＧＩＢＣＯ公司），新生　小牛血清（兰州民海生物公司），０．２５％胰蛋白酶（美国Ｓｉｇｍａ　公司），Ｍ，ＩｔＩ’（美国Ｓｉｇｍａ公司），ＤＭＳＯ（上海凌峰公司，分析　纯），Ｄ１０１型大孔吸附树脂（上海振光树脂厂），无水乙醇（南　京化学试剂厂），其他试剂均为分析纯。　１．４细胞株人胃低分化腺癌细胞株ＢＧＣ８２３（由南京大学　附属鼓楼医院肿瘤中心实验室保存）接种于完全培养液中．　３７　恒温、５％ＣＯ：、饱和湿度培养箱中生长，２～３ｄ消化传代１　次。取对数生长期细胞用于细胞毒实验。　２实验方法　２．１　重楼醇提物的制备采用本实验室通过正交实验优选　的重楼醇提物制备方法。将重楼粉碎过二号筛，置于干燥箱　６０℃过夜，称取药材粉末１００ｇ。加８倍量８０％乙醇热回流提　取３次，每次２ｈ，抽滤，滤液减压浓缩，将滤液水浴蒸干后真　空干燥制得干浸膏。将重楼醇提物用ＤＭＳＯ溶解定容至　２００ｍｇ／ｍＬ，以３０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清，过０．２２　ｍ微孔　滤膜过滤除菌，４℃冰箱保存，临用时用完全培养液稀释成所　需浓度．ＤＭＳＯ终浓度≤Ｏ．１％。　２．２重楼总皂苷的制备称取适量重楼醇提物用８０％乙醇　溶解，按体积比１：１加入ＤＩＯ１大孑Ｌ树脂拌样，蒸干后上样于　Ｄ１０１型大孔吸附树脂．以５～７倍柱体积的纯水、４０％乙醇、　７０％乙醇、９０％乙醇依次洗脱，流速：２ＢＶｆｌａ，收集各梯度滤液，　其中７０％乙醇部位滤液６０℃减压回收，将滤液水浴蒸干后真　空干燥即得重楼总皂苷。将重楼总皂苷配制成２００ｍｇ／ｍＬ的　溶液，方法同重楼醇提物。　基金项目：教育部高校博士点专项（２００８０３１５０００７）；南京市卫生局医药卫生科￣（ＹＫＫ０９０９５，ＹＫＫ０９０９７）；　南京市医学科技发展项目（ＺＫＸＩＯ０１１）　团　！璺竺竺堂竺！塑　中压；｛５

　２－３　Ｍ１－ｒ法比较重楼醇提物、重楼总皂苷、重楼皂苷Ｉ对　ＢＧＣ８２３细胞增殖的影响取对数生长期的人胃低分化腺癌　ＢＧＣ８２３细胞．加以每孔６．ＯｘｌＯ　密度活细胞接种于９６孔板，　培养２４ｈ，弃培养液，加入含药物的培养基（每组浓度设立３　个复孔）。药物终浓度分别为２５、ｌ２．５、６．２５、３．１３、１＿５６、　０．７８１ｘｇ／ｍＬ．同时设立只加完全培养液的空白对照组。置于　３７０ｃ、５％ＣＯ　饱和湿度的培养箱培养４８ｈ后每孔加入２ｏ　Ｍ　丌溶液，继续培养４ｈ后，弃上清，每孔加入ＤＭＳＯ　１５０１．ＬＬ，微型混合器震荡１０ｍｉｎ，充分溶解结晶后，用自动酶　标仪双波长（５７０／６３０ｎｍ）测定各孔的光密度值（ｏｐｔｉｃａｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ，ＯＤ值）。按公式计算肿瘤细胞增殖抑制率：　抑制率（％）＝（１一实验组０Ｄ值／对照组ＯＤ值）×１０Ｏ％　２．４集落形成实验［７１取对数生长期的人胃低分化腺癌细胞　ＢＧＣ８２３，以ＩＯ０／：￣Ｌ密度活细胞接种于２４孔板，培养２４ｈ，弃　培养液，加入含药物的培养基（每组浓度设立３个复孔），药　物终浓度分别为１２．５、６．２５、３．１３ｐ，ｇ／ｍＬ，同时设立完全培养液　的空白对照组。药物作用４８ｈ，弃上清，换完全培养液，继续培　养７ｄ，弃上清，经９５％酒精固定，结晶紫染色，在显微镜下计　数含５０个细胞以上的集落。按下式计算集落形成抑制率：　集落形成抑制率（％）＝（１一实验组集落形成数，对照组集　落形成数）ｘｌＯ０％　２．５统计学方法运用ＳＰＳＳ１７．０统计软件处理，采用ｔ检验进　行数据统计，所有数据用（础ｓ）表示。以Ｐ＜０．０５为有显著性差异。　３实验结果　３．１　比较重楼醇提物、重楼总皂苷、重楼皂苷Ｉ对ＢＧＣ８２３　细胞增殖的影响　从表１可以看出，经不同浓度的重楼醇提　物、重楼总皂苷、重楼皂苷Ｉ作用后，人胃癌细胞ＢＧＣ８２３的生　长增殖受到不同程度的抑制．并呈浓度依赖性。除２５１ｘｇ／ｍＬ浓度　外．重楼醇提物、重楼总皂苷在其余各浓度下组间抑制率比较差　异均具有统计学意义（尸＜０．０５）。在低浓度（Ｏ．７８～３．１３￣ｇｍＬ）范围　内．重楼总皂苷、重楼皂苷Ｉ组间抑制率比较差异均具有统计学　意义（Ｐ＜Ｏ．０５）。重楼醇提物、重楼总皂苷、重楼皂苷Ｉ作用于　ＢＧＣ８２３胃癌细胞４８ｈ的半数抑制浓度（ＩＣ５０）分别为（８．６３－ｚ－０．３０）、　（２．６１＿－＋０，０３）、（１．９７蝴．０１）　咖Ｌ，各组间ＩＣ５０比较差异具有统计学　意义（Ｐ＜０．０５）。重楼总皂苷对人胃癌细胞ＢＧＣ８２３的增殖抑制　作用显著强于重楼醇提物，但弱于重楼皂苷Ｉ。　表ｌ　重楼总皂苷、重楼醇提物、重楼皂苷Ｉ对　ＢＧＣ８２３细胞的增殖抑制作用（　，ｎ＝３）　

注：与重楼醇提物组比较，｝Ｐ＜０．０５；与重楼皂苷Ｉ组比　较。△Ｐ＜０．０５。　３．２重楼醇提物、重楼总皂苷、重楼皂苷Ｉ对人胃癌细胞　ＢＧＣ８２３形态的影响如图１所示，以３．１３１￣ｇ／ｍＬ浓度作用　时，重楼总皂苷、重楼皂苷Ｉ组肿瘤细胞密度减低，分裂像减　少，大部分细胞变圆皱缩，脱壁漂浮，而重楼醇提物组肿瘤细　胞形态改变不明显。以６．２５１ｘｇ／ｍＬ浓度作用时，重楼总皂苷、　重楼皂苷Ｉ组肿瘤细胞形态相似，即碎裂成沙粒状，而重楼　醇提物组部分肿瘤细胞变圆皱缩，无沙粒状改变。　■＿＿　

Ａ重楼醇提物３．１３￣ｇ／ｍＬ组Ｂ重楼总皂苷３．１３￣ｇ／ｍＬ组Ｃ重楼皂苷Ｉ　３．１３￣ｇ／ｍＬ组　■＿■　

Ｄ重楼醇提物６．２５￣ｇ／ｍＬ组Ｅ重楼总皂苷６．２５ｐ￣／ｍＬ组Ｆ重楼皂苷Ｉ　６．２５￣ｇ／ｍＬ组　图１　重楼醇提物、重楼总皂苷、重楼皂苷Ｉ作用４８ｈ后　ＢＧＣ８２３细胞的形态变化（×２ｏｏ）　（本文彩图刊登于ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｓｔｃｍ．ｅｎ“电子图片”栏目）　３Ｉ３重楼醇提物、重楼总皂苷对人胃癌细胞ＢＧＣ８２３集落形　成的影响结果见表２。不同浓度下实验组与空白对照组比较　差异均有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０５）。重楼醇提物对ＢＧＣ８２３胃癌细　胞集落形成的影响呈剂量依赖性，在３．１３、６．２５、１２．５ｔｘｇ／ｍＬ浓　度下重楼醇提物组集落形成抑制率为３０．８４％、５３．２７％、　１００％。而重楼总皂苷组在各浓度范围内均无集落形成。故重　楼总皂苷抑制集落形成的作用显著强于重楼醇提物。　表２重楼醇提物、重楼总皂苷对人胃癌细胞ＢＧＣ８２３　集落形成的影响（互　，ｎ＝３）　

注：与空白对照组比较，　Ｐ．，０．０５；与重楼醇提物组比较．　△Ｐ＜０．０５。　４讨论　在我国，中药是恶性肿瘤综合治疗的重要组成部分。随　着分子生物学的发展。药物高通量高内涵分析、筛选等技术　平台的不断提升．逐渐认识到“有效部位”是中药生物学活性　的物质基础。中药有效部位包含多种物质成分，可作用多个　靶点产生多种效应，较单个化合物的作用机制复杂，而提取　分离工艺相对简单。同时区别于通过水煎、醇提等简单提取　方法得到的中药粗提物，中药有效部位可以进一步提高药物　疗效，降低药物副反应。相对重楼皂苷单体化合物而言，重楼　总皂苷具有提取工艺相对简单和多组分、多靶点、多效应的　药效优势。相对重楼醇提物而言，重楼总皂苷具有提高药物　疗效，降低副作用等优势。　本实验采用热回流提取和大孔吸附树脂提取分离重楼　总皂苷，大孑Ｌ吸附树脂是一类新型的非离子型高分子吸附　剂，具有分离效果好，操作简单，有机溶剂使用少，可以再生　中医　坠　

田　补肾活血中药对子宫内膜异位症　大鼠生殖功能干预研究　夏亲华　沈明勤：张蕾：　（１．南京中医药大学，江苏南京２１００４６；２．江苏省中医药研究院，江苏南京２１００２８）　

摘要　目的：探讨补肾活血中药对调节子宫内膜异位症（ＥＭＳ）模型大鼠生殖功能的作用。方法：将ＥＭＳ模型大鼠　分为模型组和补肾活血汤高、中、低剂量组及阳性药组，另设假手术组．分别给药８周后观察在位内膜的ＰＲ表达和排卵　数目，剩余各组大鼠分别与雄性大鼠按２：１比例合笼。观察“孕鼠”活胎数。结果：阳性药组和补肾活血汤中、高剂量组大鼠　的在位内膜ＰＲ表达与模型组比较明显升高，阳性药组和补肾活血汤各剂量组的排卵数与模型组比较明显增多，补肾活　血汤各剂量组的活胎数与假手术组相比差异无统计学意义。结论：补肾活血中药能有效调节ＥＭＳ模型大鼠子宫内膜孕激　素受体的表达。促进卵泡发育，提高妊娠率，达到有效调节生殖功能的目的。　关键词　子宫内膜异位症补肾活血汤　子宫　卵巢　病理学　活胎数　实验研究　中图分类号Ｒ７１１．７１０．５　文献标识码Ａ　文章编号　１６７２—３９７Ｘ（２Ｏｌ１）ｏ８—００８６—０２　目前．子宫内膜异位症（ＥＭＳ）已成为影响生育最主要的　妇科疾病之一。中医药在缓解症状、调经助孕等方面疗效突　出．有西药不可比拟的优势。本研究通过观察补肾活血汤对　ＥＭＳ模型大鼠生殖功能的干预，证实其有效调节ＥＭＳ模型　大鼠生殖功能的作用，现报道如下。　１实验材料　１．１　实验药物补肾活血汤，处方：菟丝子ｌＯｇ、紫河车１０ｇ、　当归１０ｇ、川芎６ｇ、生地１０ｇ、白芍ｌＯｇ、山药１５ｇ、柴胡１０ｇ、桑　寄生１０ｇ、丹参１０ｇ，由江苏省中医药研究院制剂室制备提供　标准汤剂，每毫升药液含生药材约１．６３ｇ。己烯雌酚：０．５ｍｇｘ　１００片，合肥久联制药有限公司生产，批号：２００８０１０４。孕三烯　酮（内美通）胶囊：２．５ｍｇ／粒ｘｌ０粒，Ｐａｔｈｅｏｎ　Ｕ．Ｋ．Ｌｉｍｉｔｅｄ生产，　批号：０１８４４５。枸橼酸氯米芬片：５０ｍｇｘｌ０片．Ｃｏｄａｌ　Ｓｙｎｔｏ　Ｌｉｍｉｔｅｄ生产，批号：Ａ１１０１。　１．２仪器与试剂Ｗａｔｅｒｓ高效液相色谱仪．６００泵，２９９６型　检测器。Ｅｍｐｏｗｅｒ数据处理系统。阿魏酸对照品：中国药品生　物制品检验所，供含量测定用，批号：０７７３—９８０９。其他试剂为　市售分析纯。　和反复使用，便于工业化生产等优点，是分离中药有效成分　的重要方法。同时。本实验采用Ｍ１ｒｒ法和集落形成实验比较　重楼总皂苷、重楼醇提物、重楼皂苷Ｉ对人胃癌ＢＧＣ８２３细　胞增殖和克隆形成能力的影响，结果发现：重楼总皂苷对人　胃癌ＢＧＣ８２３细胞的生长抑制作用显著优于重楼醇提物；重　楼总皂苷和重楼皂苷Ｉ抗肿瘤的ＩＣ　虽然差异有统计学意　义，但数值相差不大且均较低。以上提示重楼总皂苷较重楼　醇提物有效提高了对人胃癌ＢＧＣ８２３细胞体外细胞生长抑　制作用。相对重楼皂苷Ｉ而言，重楼总皂苷的提取分离工艺　相对简单而体外活性相似，肯定了重楼总皂苷的提取分离工　艺．同时良好的直接细胞毒作用提示其具有一定的临床应用　潜能，因而值得进一步研究重楼总皂苷体内外抗肿瘤作用和　安全性，以及深入机理研究，明确其作用靶点和作用机理，为　指导临床用药提供理论基础。　５参考文献　Ⅲ１　国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）．北京：中国医药　科技出版杜．２０１０：２４３　『２１胡文静，钱晓萍，邹玺．重楼、土鳖虫对人肝癌ＳＭＭＣ一７７２１细胞　囝　！！！璺苎　堂苎！塑　．ｆ’压；ｉ；　增殖抑制的协同作用．南京中医药大学学报，２００７，２３（４）：２３４　【３】刘广遐，王婷婷，胡文静，等．重楼醇提物对恶性胸腹水中原代肿　瘤细胞的抗肿瘤作用．实用老年医学。２００８，２２（２）：１０１　【４］Ｋｏｎｇ　Ｍ，Ｆａｎ　Ｊ，Ｄｏｎｇ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙｐｈｙｌｌｉｎ　Ｉ　ｏｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｎｏｎ—ｓｍａｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｉｎ　ｘｅｎｏｇｒａｆｔ．Ａｃｔａ　Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ），４２（１１）：８２７　【５】Ｘｉａｏ　Ｘ，Ｂａｉ　Ｐ，Ｎｇｕｙｅｎ　ＴＭＢ，ｅｔ　ａ１．ｒｒＩｌｅ　ａｎｔｉｔｕｍｏｒａｌ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｐａｒｉｓ　Ｓａｐｏｎｉｎ　Ｉ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｔｈｍｕｇｈ　ｔｈｅ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｐａｔｈｗａｙ．Ｍｏｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒ。２００９，８（５）：１１７９　『６］范军强．重楼皂甙Ｉ抗非小细胞肺癌作用及机制的体内和体外　实验研究．浙江大学博士研究生毕业论文，２ｏｏ８　［７１张卓然．培养细胞学与细胞培养技术．上海：上海科学技术出版　社．２００４：３６４　第一作者：吴夏慧（１９８４一），硕士研究生，主要从事中医　药抗肿瘤相关研究。　通讯作者：刘宝瑞，ｂａｏｒｕｉｌｉｕ＠ｈｏｔｍ．ａｉｌ．ｃｏｍ　收稿日期：２０１１－０４—１２　

编辑：吴　宁