第37卷第1期 2007年2月工业微生物IndustrialMicrobiology Vol.37No.1 Feb.2007
基金项目:厦门市科技计划资助项目(编号:3502Z20031079);
作者简介:王颖(1983～),女,硕士研究生;
3通讯作者。Tel:86-592-2183088;Fax:86-592-2184822;E2mail:ylu@xmu.edu.cn
酿酒酵母S.cerevisiae高密度培养条件优化研究王 颖, 何 宁, 李清彪, 邓 旭, 卢英华3(厦门大学化学工程与生物工程系,厦门361005)
摘 要 考察了培养基组成和培养条件对酿酒酵母Saccharomycescerevisiae发酵的影响。以TB培养基为初始培养基,通过正交实验设计优化培养基组成,确定了影响酵母细胞产量最主要的因素是葡萄糖,最适培养基组成为:酪蛋白胨15g/L,酵母粉25g/L,葡萄糖30g/L,KH
2PO42.4
g/L,K2HPO4・3H2O16.34g/L。并确定了最佳培养条件:温度30℃,转速150r/min。采用优化培养基及培养条件下进行发酵,菌液最高OD600值和细胞密度分别达15.82和2.03×10
8
/mL,比
优化前分别提高24.2%和22.0%。关键词:酿酒酵母; 培养基; 培养条件; 正交实验
近代基因技术的进步使人们可以利用微生物大量生产高价值的生物药物及其它重组蛋白。发酵产物的多少通常与细胞密度的高低关联,因此发酵过程的首要任务通常是研究如何尽可能地达到高的细胞密度,以便提高生产率、简化下游加工、减少废水排放量、降低培养容积、生产成本及设备投资,使目的产物产生良好的成本效益[1]。 优化培养基是一种提高细胞密度的有效方法。培养基分复合培养基、半合成培养基和合成培养基三种[2]。合成培养基成分和浓度已知且可以控制,常用来获得高细胞密度;复合培养基含有提取物(如蛋白胨,酵母提取物),营养物的成分和质量可能不同,故复合培养基进行发酵过程的重复性较差。然而,复合培养基和半合成培基对促进产物生成是必要的,而且在复合培养基和半合成培基中,细胞生长往往比在合成培基中快[3]。为使细胞生长达到高密度,有必要设计一种含必需成分的平衡性营养培养基,以维持细胞生长,同时避免生长的抑制。 酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为人类利用最早的微生物,其营养成分十分丰富,含有菌体蛋白质、多种氨基酸、维生素、脂肪、食物纤维、矿物元素、微量元素及生理活性物质等[4]。由于其具有安全、生长繁殖快、代谢周期短、容易进行大规模培养、菌体蛋白质丰富等优点,一直是基础和应用研究的主要对象,并被广泛应用于酿造、食品、医药、饲料工业等领域[5]。近年来,世界各国均在积极采用微生物发酵技术开发酵母菌市场。此外,酿酒酵母还是外源基因理想的真核生物表达系统,并与盘基网柄菌D.discoideum一起,于2000年被NIH选为标准微生物模型系统(http://www.nih.gov/sci2ence/)。
国内外对酿酒酵母菌培养的实验研究已有了较多的报道。Raj等采用合成培养基,可获得140g/L
的细胞干重[6]。Park等在内置膜过滤反应器内连续培养酿酒酵母,得到13g/(L・h)的细胞干重[7]。赵宝华等探讨了外加Ca2+、La3+对酿酒酵母生长的影响[8]。梅乐和等研究了酿酒酵母微囊化培养过程[9]。此外,也有不少研究集中在基因工程和固定化技术于酿酒酵母生产中的应用[10～12]。本文以TB培养基(一种培养大肠杆菌的简单复合培养基)为基础,考察了培养基成分和浓度,以及培养条件等对酿酒酵母发酵培养的影响,并利用正交实验对培养基进行了优化,开发出了一个适合高密度培养酿酒酵母菌的简单复合培养基。
—43—1 材料和方法1.1 菌种 酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae),由厦门大学生物系提供。1.2 主要试剂 酪蛋白胨(北京陆桥技术有限责任公司产品),酵母粉(英国OXOID公司产品),葡萄糖(上海化学试剂站分装厂产品),甘油(中国医药(集团)上海化学试剂公司产品),磷酸二氢钾(上海试剂二厂产品),磷酸氢二钾(汕头市西陇化工厂产品)。1.3 TB培养基 于800mL蒸馏水中加入酪蛋白胨12g,酵母粉24g,甘油4g;100mL蒸馏水中加入葡萄糖20g。100mL蒸馏水中加入KH2PO42.4g,K2HPO4・3H2O16.34g。 上述三部分各自溶解,121℃蒸汽灭菌20min,冷却后混合。该培养基作为种子培养基和正交实验优化设计的初始培养基。1.4 培养方法1.4.1 摇瓶种子培养 从冷冻甘油管中接种酵母细胞至装有30mLTB培养基的250mL三角瓶中培养,摇瓶转速为200r/min,温度为28℃,培养时间为30h。1.4.2 摇瓶发酵培养 将上述种子液接入50mL/250mL锥形瓶中,控制接种量使得菌液初始细胞密度为4～6×105/mL。摇床(28℃、150r/min)培养,每隔3至4h取样测定。1.4.3 发酵罐分批培养 发酵罐分批培养在美国Cole2ParmerInstru2mentCompany生产的3L发酵罐中进行。在发酵罐中装入2L优化后培养基,接入种子液,控制接种量使得菌液初始细胞密度为4～6×105/mL。温度通过循环水浴控制在30℃,pH值通过自动流加1mol/LNaOH或5%H3PO4溶液控制pH在7.5。通气速率为2L/(L・min)。搅拌转速为200r/min,当溶氧降至20%以下时,提高搅拌转速以使溶氧恢复至20%。1.5 正交实验设计 培养基中酪蛋白胨、酵母粉、甘油以及葡萄糖4个因素的浓度对酿酒酵母生长的影响可以利用正交实验进行优化。每个因素取3个水平,采用的四因素三水平正交实验见表1。在28℃,150r/min条件下培养,测定菌液的最大OD600值。表1 培养基正交实验因素及水平表水平LevelA酪蛋白胨(g/L)B酵母粉(g/L)C甘油(g/L)D
葡萄糖(g/L)
1515002102021031525420
1.6 分析方法 (1)比浊法测定菌液浓度:将培养液直接或做适当稀释后,用722型分光光度计(厦门分析仪器厂)以超纯水为参照测定菌液的吸光度OD600值。 (2)血球计数法测定细胞密度:培养液经适当稀释,吸取经过适当稀释后的菌悬液,滴至血球计数板,在显微镜下直接计数。
2 结果与讨论2.1 发酵培养基的优化实验 通过正交实验对培养基配方进行优化,实验结果及其极差分析见表2。表2 正交实验结果及其极差分析
实验号ABCD
OD
600
111111.62212227.28313338.924212310.30522314.326231210.327313211.228321312.60933215.20M117.8223.1424.5611.16
M224.9624.1922.8028.84
M329.0624.4924.4631.82
m15.947.718.193.72
m28.328.067.609.61
m29.688.168.1610.61
R3.740.440.586.89
从表2的实验结果中可看出,在9次实验中以第8号实验的OD600值最大,高达12.60,相应的水平组合A3B2C1D3是当前最好的水平搭配。 从表2的极差分析及图1中可以看出,四个因—53—
第1期王 颖,等:酿酒酵母S.cerevisiae高密度培养条件优化研究第37卷 素对酿酒酵母菌生长的影响顺序为葡萄糖>酪蛋白胨>甘油>酵母粉。由趋势图选择四个因素的最佳浓度:(1)酪蛋白胨(因素A)对酵母菌生长有较大的影响,其浓度越高,菌液的OD600值也越高,故选取最高水平15g/L。(2)酵母粉(因素B)对酵母菌生长无显著的影响,为降低成本选取最低水平,即酵母粉的加入量为15g/L。(3)甘油(因素C)对酵母菌生长有一定的影响。由因素水平表和趋势图可以看出,培养基中不添加甘油,菌液的浓度反而更高,说明甘油不是该菌株的合适碳源,而葡萄糖作为碳源已能满足该菌株的生长需求。故甘油加入量选取最低水平0g/L,即不加甘油。(4)葡萄糖(因素D)对酵母菌生长有显著的影响,葡萄糖浓度的增加使菌液的最大OD600值明显增大,这主要是由于酵母以糖类物质为能源和碳源,供生命活动所需[13],因此培养基中葡萄糖的浓度是非常关键的因素,适当增加葡萄糖浓度将非常有利细胞的生长。所以选取最高水平20g/L。图1 菌液最大OD600值与四个因素的关系 上述分析表明最佳培养基配方可能为A3B1C1D3。此组合不在上述9个实验组合中,因此需和实验得出的最优组合A3B2C1D3进行比较。在28℃,150r/min下,用A3B2C1D3和A3B1C1D3两个培养基配方培养酿酒酵母,菌液的最大OD600值分别为12.44和12.18,两者相差不大。从节约成本的角度考虑,选取培养基浓度较低的组合A3B1C1D3为较优组合。此外,因为葡萄糖是影响酵母生长的最主要因素,而由实验获得的优化条件中葡萄糖浓度是三个水平中的最高水平,为了全面了解其影响,需对更高葡萄糖浓度下发酵过程进行研究。因此通过追加实验进一步探索葡萄糖浓度更高的情况,以确定最佳培养基组成。2.2 增加葡萄糖浓度对细胞密度的影响 考察更高葡萄糖浓度下的酿酒酵母发酵过程。选取20g/L、30g/L、40g/L、50g/L四个葡萄糖浓度,其它组分浓度均采用上文确定的最佳浓度,在28℃,150r/min下培养,测定菌液的最大OD600值
及细胞密度,实验结果如图2所示。
图2 葡萄糖浓度对酵母菌生长的影响 从图2可以看出,随着葡萄糖浓度的升高,酵母菌液的OD600值和细胞密度均上升。但有实验证明当葡萄糖浓度大于50g/L时,对酵母的发酵都有抑制作用[14]。还可看出,葡萄糖加入量在30g/L以上时,菌液的OD600值和细胞密度的提高幅度已经趋于平缓。因此,选取葡萄糖的加入量为30g/L。 综合考虑培养基成本及多因素对酿酒酵母发酵的影响,得到酿酒酵母S.cerevisiae的最优培养基为:酪蛋白胨15g/L,酵母粉15g/L,葡萄糖30g/
L,KH2PO42.4g/L,K2HPO4・3H2O16.34g/L。2.3 转速对酿酒酵母生长的影响 设定摇床转速为100、150和200r/min,考察不同转速对酿酒酵母发酵过程的影响。采用优化后的培养基,在28℃下培养,于不同发酵时间取样测细胞密度,绘制菌体生长曲线,如图3所示。 由图3可看出,转速为100r/min时,酵母生长较快,发酵时间较短,可以在20h结束发酵,但菌液的最大浓度较低,细菌数较少;转速为200r/min