第30卷第1期2010年1月国际病理科学与临床杂志 htt p://www .gjbl .netI nternati onal Journal of Pathol ogy and ClinicalMedicineVol .30 No .1Jan . 2010收稿日期:2009-10-09 修回日期:2010-01-23作者简介:赵秀华,硕士研究生,主要从事成体干细胞的研究。
通讯作者:程腊梅,E 2mail:chenglamei2000@yahoo .com基金项目:国家重点基础研究发展计划项目(2007CB947900);湖南省自然科学基金重点项目(08JJ3075)。
The work was supported byNati onal Key Basic Research and Devel opment Pr ojects (2007CB947900)and Key Pr ojects of Natural Science Foundati on of Hunan Pr ovince,P .R.China (08JJ3075).・Arti cles ・・论 著・小鼠肝脏窦状内皮细胞分离和培养的一种新方法赵秀华,罗彬,罗盘,程腊梅(中南大学生殖与干细胞工程研究所,长沙410078)[摘要] 目的:建立小鼠肝窦状内皮细胞(liver sinus oidal endothelial cells,LSEC )的分离培养方法,研究其生物学特性。
方法:中性蛋白酶消化小鼠肝脏组织,Percoll 密度梯度离心分离消化后的细胞悬液,用内皮细胞筛选培养基及酶差异消化法纯化LSEC;免疫细胞化学染色检测LSEC 的表面标志,分析LSEC 的超微结构,观察D iI 荧光标记的乙酰低密度脂蛋白(acetylated 2l ow density li pop r otein,D iI 2Ac 2LDL )摄取能力,以体外成血管能力分析LSEC 的功能。
结果:分离纯化后的细胞呈典型鹅卵石样内皮细胞形态,这些细胞表达V III 因子,不表达CD31,CD90和CK19,具有窦状内皮细胞特征性的窗孔结构;能摄取D iI 2Ac 2LDL,并有一定的成血管能力。
结论:建立了一种分离、培养LSEC 的方法,为研究LSEC 的功能奠定了基础。
[关键词] 肝窦状内皮细胞; 条件培养基; 窗孔; 成血管结构; 小鼠doi:10.3969/j .issn .167322588.2010.01.001A new m ethod for the isol a ti on and culture ofli ver si n uso i da l endotheli a l cellsZ HAO Xiuhua,LUO B ing,LUO Pan,CHENG La mei(Institute of Reproductive and S te m Cell Engineering,Central South U niversity,Changsha 410078,China )[Abstract] O bjecti ve T o establish a method f or the is olati on and culture of mouse liver sinu 2s oidal endothelial cells (LSEC ),and t o study their bi ol ogical characteristics .M ethods L iver tissue fr om mouse was treated with a s oluti on containing 2U /mL dis pase,and then the cell sus pensi on was separated by Percoll density gradient centrifugati on .LSEC was purified by culturing in an endothelial cell selective mediu m and passaged with enzy me discrepancy digesti on .LSEC i m munophenoty p ic characteristicswere an 2alyzed by using cyt o 2i m munostaining .The ultrastructures of LSEC,the ability of up taking the acetylated l ow 2density li pop r otein (acetylated LDL ),and the vascular structures in vitr o were detected .Results The is olated cells showed the typ ical cobblest one mor phol ogy characteristic of endothelial cells .These cells ex 2p ressed fact or Ⅷbut not CD31,C D90,and CK19.They were able t o up take the acetylated l ow 2density li p 2op r otein and t o f or m vascular structure .The results of electr on m icr oscope sho wed that these cells possessed typ ical transcellular fenestrati ons with a sinus oidal origin .Conclusi on W e devel op a method f or the1第1期国际病理科学与临床杂志 htt p://第30卷is olati on and culture of LSEC with ty p ical mor phol ogic and phenotyp ic characteristics.[Key words] liver sinus oidal endothelial cell; conditi oned mediu m; fenestratre; vascular structures; m ice[I nt J Pathol Clin Med,2010,30(1):0001207] 肝窦状内皮细胞(liver sinus oidal endothelial cells, LSEC)是肝脏内所占比例最高的非实质细胞,约占肝非实质细胞总数的30%,位于肝窦腔与肝细胞之间[1]。
LSEC不仅在肝脏微循环、肝再生、肝移植缺血再灌注损伤及移植免疫耐受的诱导过程中发挥着非常重要的作用[2],而且在个体发育过程中为造血的发育提供了合适的微环境[3],因此其研究日益受到关注。
小鼠肝脏窦状内皮细胞的结构、免疫表型和功能特性与一般血管内皮细胞和内皮祖细胞均有较大差异,它们具有一般内皮细胞和内皮祖细胞所没有的窗孔结构、细胞间连结松散、内皮下缺少基底膜等结构[4]。
本文旨在建立小鼠肝脏窦状内皮细胞的分离、培养方法,为研究其生物学特性奠定基础。
1 材料与方法1.1 试剂与材料健康4周龄昆明白小鼠,雌雄不限,由中南大学实验动物中心提供。
磷酸盐缓冲液(P BS)、中性蛋白酶(dis pase)、0.05%胰酶2E DT A(T/E)、进口胎牛血清(fetal bovine seru m,F BS)购于美国Gibco公司;DA2 P I,纤连蛋白(fibr onectin),MC DB131,Percoll购于美国Sig ma公司;羊抗鼠CK19抗体、地塞米松购于美国Santa Cruz公司;EG M22购于Lonza公司;VEGF, bFGF,A lex488标记的山羊抗大鼠、F I T C标记的大鼠抗小鼠二抗购于美国I nvitr ogen公司;Aqua B l ock T M/ E I A/WB购于Eastcoastbi o公司;小鼠抗小鼠v W F抗体购于美国BD公司;大鼠抗小鼠C D31,小鼠抗小鼠CD90抗体购于美国Abca m公司。
AEC染色试剂盒为Ther mo公司产品;CO2培养箱为美国For ma Scien2 tific公司产品;光学显微镜、荧光显微镜、倒置相差显微镜为日本O ly mpus公司产品;流式细胞仪为美国BD公司产品;扫描电镜为日本电子株式会社(JE OL)产品。
1.2 LSEC的分离分离方法参考文献[5],并加以改进。
75%酒精消毒小鼠,无菌条件下取出肝脏,P BS冲洗去除血液,并去除包膜、血管、胆管、结缔组织。
将肝脏剪成1.7mm×1.7mm×1.7mm大小立方块后转移到培养皿中,加入2U/mL中性蛋白酶(dis pase)溶液,4℃消化过夜,用平头镊子充分挤压肝脏组织块以释放肝窦状内皮细胞,100目不锈钢筛网过滤,离心,于MC2 DB131培养液中重悬后离心洗涤细胞(2000r/ m in,10m in),最终细胞重悬于MCDB131培养液中。
在离心管中依次加入35%Percoll和细胞悬液,15000r/m in,4℃离心10m in,收集富含窦状内皮细胞的带,离心洗涤(2000r/m in,10m in),再次低速离心洗涤(600r/m in,5m in),细胞重悬,计数。
1.3 内皮条件培养基的制备小鼠骨髓内皮细胞(中南大学王绮如教授赠)培养于含10%F BS的I M DM中。
待细胞生长至汇合度达80%时,将培养基替换为I M DM继续培养,24 h后收集培养基,离心、过滤,滤液则为内皮细胞条件培养液。
将制备的内皮细胞条件培养液于-20℃冰箱储存备用。
1.4 LSEC的培养将分离得到的细胞重悬于内皮细胞选择性培养基,以1×106/mL密度接种在6孔细胞培养板中, 37℃,5%CO2条件下,培养5h,去掉非贴壁细胞,贴壁细胞在内皮细胞选择性培养中继续培养。
培养7d后0.05%胰酶2E DT A消化,消化过程中基质细胞先于窦状内皮细胞收缩,待细胞开始收缩,立即终止消化,贴壁细胞用P BS洗2遍后,继续纯化培养。
每2天换液1次,胰蛋白酶消化传代。
内皮细胞选择性培养基为40%MCDB131,40%EG M22和10%小鼠骨髓内皮细胞条件培养液,其中含10%进口F BS, 1%L2谷氨酰胺,10ng/mL VEGF,10ng/mL bFGF, 1ng/mL地塞米松。