2. 染色步骤 （1）石蜡切片脱蜡至蒸馏水； （2）消化暴露抗原： （3）去除内源性酶 （4）滴加适当稀释的一抗； （5）滴加适当稀释的生物素化的二抗； （6）滴加ABC复合物等三抗； （7）滴加底物显色； （8）苏木素复染核，脱水透明封片。 以上(1)-(5)之间均用缓冲液洗。
3. 结果判定 HRP-DAB: 阳性呈棕黄或棕黑色
分子病理学授 课
复习题
1 什么是分子病理学？ 常用分子病理技术有哪些？ 2 什么是免疫组织化学？ 试述免疫酶组织化学的方法和原理。
一、概论 生物高新技术——病理学中的应用 向二方面发展：
计算机和图像分析技术的应用
简单的形态描述——量化方面发展 直接观察——远程远输“间接”观察 定量病理学和远程病理学 原位杂交、原位PCR和原位末端标记技术
2）免疫组化技术 也是在蛋白水平原位检测基因表达的一种方法。
是在组织细胞原位检测抗原（或抗体）的一种方法，
2.历史 1914年，Coons等人首次用荧光素标记抗 体检测肺炎双球菌的成功，开创了免疫组 化的新时代 Sternberger改进并建立了辣根过氧化物 酶－抗过氧化物酶（PAP）技术。 80年代以后，ABC、APAAP、LSAB法 等，使免疫组化技术的应用更加广泛，成 为当今生物医学中形态、功能、代谢等综 合研究的一种有力工具。
AP-Fast red: 玫瑰红色
AP-NBT, BCIP: 紫蓝色
HRP-DAB: 棕黄或棕黑色
AP-Fast red: 玫瑰红色
4. 对照实验 （1）空白对照：一抗由 TBS 或其他无关抗体取代。 （2）阴性对照：二抗和/或三抗一抗 由 TBS或其他无关抗体取代。 （3）阳性对照：用含已知靶抗原的切片 作阳性对照。
直接法免疫荧光原理示意图
间接法免疫荧光原理示意图
4. 免疫酶组织化学
60年代初，HRP-抗体分子上，开创了酶标记抗体的 新技术，现已广泛应用。目前应用最广泛的酶是HRP， 其次是AP。 （1） PAP法Ag→Ab1→Ab2→PAP→DAB 其灵敏度是免疫荧光法的100-1000倍 （2） ABC法: Ag→ Ab1→ Bio-Ab2→ABC→DAB （3) APAAP法: Ag→Ab1→Ab2→APAAP→FR （4） LSAB或SP法: Ag→Ab1→Bio-Ab2→HRP-SA DAB （AP-SA）→ （FR /NBT）
研究内容--阐明疾病的病理机理 （1）“大海捞针”式探讨单个致病基因
与疾病关系研究—人类基因组计划
（2）信号转导—疾病关系
认清疾病发生的信号转导机制
最终阐明其机制
寻求干预和防治疾病
病理学发展以方法为先导 人类科学进步的历史和学科的发展—— 以研究方法与工具创新为先导 一项新技术的创立，随之带来一批新的 研究成果
在病理学领域中
系统解剖—LM—EM—免疫组化技术
器官病理学—细胞病理学—免疫病理学
原位杂交和原位PCR技术的兴起，又将病 理学这门有着悠久历史的学科推进到分子 病理学水平
21世纪是生命科学的世纪 分子生物学是生命科学的带头学科
随着生物高新技术在病理学中应用的不断 增多，分子病理学将在此研究领域中占有 越来越重要的位置
2. 按标记物标记的部位分 直按法（一步法） 间接法（二步法） 桥联法（多步法）
目前应用最为广泛的为免疫酶法 根据三抗、酶的不同又分为 PAP法、APAAP法、BA法 ABC法、LSAB法和SP法等。
3. 免疫荧光法 已知的抗体或抗原分子标记上荧光素 与其相对应的抗原或抗体起反应 形成的免疫复合物上带有一定量的荧光素 荧光显微镜下——荧光的抗原抗体结合部位 检测出抗原或抗体
四、免疫组化染色的一般注意事项 1. 内源酶的灭活及内源生物素的处理 HRP—3％的H2O2水溶液 含丰富血细胞的标本中，与H2O2产生 强烈的反应，出现冒泡而破坏组织结构和 细胞形态。 可以用3％的H2O2甲醇液
内源性生物素的去除：
目的：正常细胞也含有生物素，尤以肝、 脾、肾组织含量为多。在应用亲和素试剂的 染色中，内源性生物素易结合后继抗体，形 成亲和素(或链亲合素)-生物素复合物，导致 假阳性发生。 方法：在采用生物素方法染色前，对标本 进行亲和素处理，使其结合位点饱和。
近些年来，由于原位杂交技术、流式
细胞仪及图像分析等技术的兴起和应用，
使免疫组化引向基因水平和定量检测
形成免疫组化新的分支
杂交免疫组化和定量免疫组化。
90年代初, 原位PCR技术的诞生
免疫组化主要是用来原位PCR结果的化学
放大和显示，标志着免疫组化技术又进入
了一个新的发展阶段。
二、 方法和原理 1. 按标记物种类分: 免疫荧光法 免疫酶法 免疫铁蛋白法 免疫金法及放射免疫自显影法
直接法免疫酶组织化学原理示意图
间接法免疫酶组织化学原理示意图
NBT
HRP-DAB
AP-坚固红
ABC
LSAB
PAP APAAP
Ab2
Ab1
Bio-Ab2 Ab1
Ag
Ag
多步法免疫酶组织化学原理示意图
பைடு நூலகம்
三、免疫组织化学方法基本步骤 1. 试剂配制
（1）柠檬酸盐缓冲液 （2）TBS (Tris 缓冲生理盐水) （3） 1M Tris-HCl 缓冲液( pH 7.4 ) （4） 显色液: （5） Mayer苏木精复染液
免疫组织化学技术
一、概论：概念
二、方法和原理
三、免疫组织化学方法基本步骤
四、免疫组化染色的一般注意事项
一、概论
1. 概念： 1）免疫组织化学（immunohistochemistry） 是组织学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗 原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织原位的显 示；是免疫学与组织化学相互渗透、相互交叉而产生的 一门学科。
分子病理学水平
近些年来，尤其是纳米技术的诞生
使人们对疾病的认识达原子水平
分子病理学 从分子水平研究患病机体生命现象的科学 从分子水平研究疾病的发生、发展与转归机 制的科学 分子生物学 细胞生物学 经典病理学
互相渗透、交叉
分子病理学的形成是分子生物学技术在病理 学中的应用的具体体现。
技术手段 （1） 分子免疫学+病理学乃至形态科学-— 免疫组织化学 （2）分子生物学技术 （探针；PCR；分子杂交）+形态学科 ISH、IS PCR和原位末端标记技术 (3) 生物芯片技术—组织芯片技术 (4) 纳米技术—对疾病的认识达原子水平