科研人员可同时研究几百甚至上千种不同阶段病理生理状态下的 组织样本的某一个或多个特定基因或相关表达产物
Tissue Microarray
组织病理制片技术
显微切割：microdissection
选取同质性研究材料，是在对组织的深入研究中 常常遇到却又不易解决的问题
该技术是在显微状态下或显微直视下通过显微操作系统对选 择的材料（组织、细胞、细胞群、细胞内组分或染色体带等） 进行切割分离并收集用于后续研究的技术
组织固定的方法
蒸汽固定法 某些薄膜组织及血液或细胞涂片中的可溶物质
浸入法
手术取材组织标本和细胞涂片
灌注法
仅适用于动物实验
微波固定法
常用固定剂
醛类固定剂
双功能交联剂，可使组织间相互交联，原位保存抗原 对组织穿透力强，收缩性小 是最常用固定剂
10%中性福尔马林液 4%多聚甲醛缓冲液 2.5%戊二醛（电镜）
在慢性炎症、机化和瘢痕形成等病变中显示胶原纤维，如慢 性肾小球肾炎的肾小球纤维化、大叶性肺炎、血栓机化、风 湿性肉芽肿时Aschoff’s巨细胞消失、胃、十二指肠溃疡愈合、 慢性阑尾炎、肝硬化。
适用于多肽类激素的组织固定
非醛类固定剂 常需与戊二醛或多聚甲醛混合适用降低边缘效应
丙酮及醇类固定剂
穿透性很强，保存抗原活性较好 常用于冰冻切片及细胞涂片固定
组织病理制片技术 常规组织病理制片
脱水，透明，浸蜡，包埋，切片
组织病理制片技术
组织芯片
近年来基因芯片（DNA芯片）技术的发展和延伸，与细胞芯片、蛋 白芯片、抗体芯片一样，属于特殊生物芯片技术 组织芯片技术可将数十个甚至上千个不同个体的临床组织标本按预 先设计的顺序排列在一张玻片进行分析研究，是一种高通量、多样 本的分析工具
显微切割技术的特点
细微：微米、纳米级切割 原位：所取材料定位清楚 同质：所取材料在一定层次上相同 结合：与其他实验技术结合
显微切割本身不能对样品 进行研究，必须同其他实 验技术结合，其切割目标 完全取决于研究目的
显微切割的方式
手动直接显微切割 机械辅助显微切割 液压控制显微切割 激光捕获显微切割（laser capture microdessection, LCM）
HE染色能非常鲜明地对组织和细胞 染色，是最基本、使用最广泛的技 术方法，又被称为常规染色。
特殊染色
显示HE染色不明显的目的物，如Gridley染色能 突出显示感染的霉菌
区别常规HE染色不能鉴别的病变，如V.G染色可 区分胶原纤维和平滑肌
显示某些常规HE染色中不能看到的目的物，如 网状纤维、星形细胞的突起和结核杆菌等
医学实验技术原理及选择
常用医学实验动物模型的种类及选择 组织学实验技术 细胞生物学实验技术 分子生物学实验技术 蛋白质化学技术 免疫学实验技术 医学微生物学实验技术
分子病理学常用实验方法
• 组织标本取材与固定 • 病理制片 • 切片 • 染色：常规/特殊 • 原位蛋白质检测 • 原位核酸检测
组织标本一般处理流程
结缔组织染色 胶原纤维染色
分布最广、含量最多的一种纤维

Van Gieson氏苦味酸—酸性 品红染色法（简称V.G法） Masson氏三色染色法 Mallory氏三色染色法 Pollak氏三色染色法 Sirius Red苦味酸法等
胶原纤维染色的应用
在病理诊断上主要用于和肌纤维相鉴别
来源于间胚叶的肿瘤如纤维瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、神经 纤维瘤及其肉瘤等的诊断和鉴别诊断。
细胞悬液
IF、FCM
细胞取材方法适用范围及优缺点比较
印片法
穿刺法
沉淀法 细胞爬片法
适用范围 活检组织标本、 实质器官的病
手术切除标本的 变区细胞取材 细胞取材
体液多细胞少 的标本
有贴壁生长特性 的细胞，如纤维 母细胞、粘液癌 细胞
优 点 简便省时，细胞 操作简便，细 操作简便，细 操作简便，保持
抗原保存较好 胞形态保持较 胞形态保持较 细胞形态及活性
全自动组织处理机
石蜡包埋机
石蜡切片机 硬组织切片机
震荡切片机 冰冻切片机
冰冻切片机
常用组织切片染色方法
未经染色的组织切片各部分折射率差别很小，即使有足够的分 辨率和合适的放大倍数，也无法直接在光镜下观察。 通过适当的染色，增大各部分结构折射率差别，提高分辨率
苏木精－伊红染色（HE）
DNA带负电荷，呈酸性，与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键形式结合，呈蓝色 伊红Y为一种合成酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与嗜酸性物质结合呈红色
好
好
缺点
细胞分布不均匀，细胞分布不均 细胞分布不均 适用细胞种类较
易重叠，影响标 匀
匀，易重叠， 少
记效果
影响标记效果
组织固定
定义：将组织浸入适当化学试剂，使细胞内 物质尽量接近其生理状态时的形态结 构和位置的过程
意义： 防止自溶 防止腐败 最大限度保存细胞和组织的抗原性 保留特殊成分：糖原、核酸、色素等
科研水平先进性
工欲善其事必先利其器
选择实验方法的基本原则
必要性
为什么要选择这个方法 替代方法
可行性
实验室条件 经费 时间
基于硬件条件，选择最具有说服力的方法
1．为没有工作经验的医学研究生编写 一本适合自学的手册式教材，为他们 做课题时更快、更好地选择合适的实 验技术提供决策参考。 2．重点介绍同类实验技术的发展沿革、 优劣比较；不同实验技术的特点、用 途、相互关系、发展趋势；各类实验 技术的关键、操作要点和选择示范。 3．重点强调医学实验技术的原理与选 择，而非具体操作，亦非理论知识。
组织取材
固定
不固定
包埋 冻存（不提倡）
冻存
冰冻切片
HE染色 特殊染色
IHC ISH 电镜
蛋白质、核酸提取 固定
不固定
分子生物学实验 -20℃保存 IF/IHC/ISH
细胞标本一般处理流程
活细胞
细胞爬片
细胞离心涂片 细胞培养
固定
形态学 IHC ISH
离心后包埋制片
冻存 Protein/DNA/RNA 分子生物学
分子病理学常用研究方法 原理及选择
实验方法在科研工作中的意义
决定本项研究的意义与水平：
①高水平假说+高精尖手段→高水平的研究 ②高水平假说+一般手段→高水平的研究 ③低水平假说+高精尖手段→一般水平的研究 ④低水平假说+一般手段→低水平的研究
From Prof. XW Bian
立题的先进性 手段的先进性