不合格
复试5只动物中体温升高＞ 0.6℃的动物超过1只；或合 并初始、复试8只动物体温
升高总和＞3.5℃
合并初试、复试8只动物， 体温升高超过0.5℃的动物 数＞3只，体温升高总数＞
3.3℃
英国药 加试3只动物， 典 最多加试三组， 合并初试共12 只动物
6只体温升高总和≤2.80℃ 9只体温升高总和≤4.45℃ 12只体温升高总和≤6.60℃
了研究。
2010版欧洲药典已收录了5种新体外热原检测方法： ① 人新鲜全血—IL-1β法 ② 人新鲜全血—IL-6法 ③ 人冻存全血—IL-1β法 ④ MM6细胞—IL-6法 ⑤ PBMC细胞—IL-6法
新方法优点
① 不使用动物进行体内实验 ② 能真实地模拟人体对热原的反应 ③ 能检测非内毒素热原 ④ 能定量或半定量 ⑤ 能被广泛地应用 ⑥ 操作简单可行
英国药 典
1-3天 10ml/kg 10次 体温在38.0-39.8℃之间，
生理盐水 30min/次， （38.5℃） 舍去前2次
个体间体温差≤1℃
注意事项
1. 抓取兔子的正确方法：一手抓持兔颈背部皮毛，一手托起兔臀部。 2. 在热原检查前1～2日，供试用家兔应尽可能处于同一温度的环境中，
实验室和饲养室的温度相差不得大于3℃，在试验全部过程中，应注 意室温变化不得大于3℃。 3. 应避免噪音干扰。 4. 整个试验操作过程应尽量轻柔，避免激惹动物，造成体温大幅波动， 影响结果。 5. 家兔在试验前至少1小时停止给食并置于适宜的装置中,直至试验完毕。 6. 读取体温：一手拿住体温计尾部，使眼与体温计保持同一水平，然后 慢慢地转动体温计 ，从正面看到水银柱时就可读出相应的温度值 ， 切记不可用手碰触水银球端 7. 静脉给药前需将供试品温热至38℃（美国药典37±2℃，英国药典 38.5℃），注射要缓慢。
热源的性质
热原除具有很强的致热性外，还具有下列性质： 耐热性：180℃2小时以上或250℃30min以上才能彻底破坏热 原。因此，玻璃制品如生产过程中所用的容器和注射时使用的 注射器等，均可用高温破坏热原。 水溶性：热原能溶于水，可用大量无热原注射用水冲洗以除 去热原。 不挥发性：热原本身不挥发，但可随水蒸汽雾滴带入蒸馏水 中，故用蒸馏法制备注射用水时，蒸馏水器应有隔离装置。 滤过性：热原体积极小,直径1~50nm,可通过普通滤器进入滤 液中。 不耐强酸、强碱、强氧化剂：热原能被盐酸、硫酸、氢氧化 钠、高锰酸钾、重铬酸钾等所破坏。
热原检查法的定义
本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体 内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况， 以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定
实验耗材去热原
试验用的注射器、针头及 一切和供试品溶液接触的耐高 温器皿,应置烘箱中用250℃加 热30分钟（英国药典200℃1h）
不耐高温器皿可置于30％ 双氧水中浸泡4h，再用细菌内 毒素检查用水充分冲洗，60℃ 烘干备用
•
中国药 典
美国药 典
实验步骤
另取5只动物 进行复试，试 验方法同初试
另取5只动物 进行复试，试 验方法初试
合格
复试5只动物中体温升高 ≥0.6℃的动物数不超过1只， 合并初试三只动物，体温升
高总和≤3.5℃
合并初试、复试8只动物， 体温升高超过0.5℃的动物数 ≤3只，或者超过3只，但体
温升高总数≤3.3℃
6只体温升高总和＞ 4.30℃ 9只体温升高总和＞ 5.95℃ 12只体温升高总和＞ 6.60℃
传统热原检测方法的不足
家兔法：
费用高 结果重复性差 使用活体动物实 验
内毒素法：
只能检测细菌内毒素 鲎（hòu）资源日益 匮乏
蓝血的活化石--鲎
鲎（hòu）亦称马蹄蟹。肢口纲
（Merostomata）剑尾目（Xiphosura）海 生节肢动物，共4种，见于亚洲和北美东海 岸。虽又称马蹄蟹，但不是蟹，而与蝎、 蜘蛛以及已绝灭的三叶虫有亲缘关系。 鲎 (horseshoe crab)是一类与三叶虫 （现在只 有化石）一样古老的动物。鲎的祖先出现 在地质历史时期古生代的泥盆纪，当时恐 龙尚未崛起，原始鱼类刚刚问世，随着时 间的推移，与它同时代的动物或者进化、 或者灭绝，而惟独只有鲎从4 亿多年前问 世至今仍保留其原始而古老的相貌,所以鲎 有“活化石”之称。
鲎具有很高的药用价值,，它
的血液中含有铜离子，它的血 液是蓝色的。这种蓝色血液的 提取物——“鲎试剂”，可以 准确、快速地检测人体内部组 织是否因细菌感染而致病；在 制药和食品工业中，可用它对 毒素污染进行监测。科学家也 使用鲎血研究癌症。但是，对 鲎抽血后，它们就被放生
随着各种新技术产品的出现及现 有方法存在的问题，传统热原检测 方法日趋落后，不适应于产品的热 原检测。
热原与细菌内毒素的 区别
热原物质包括了细菌内毒素，细菌内毒素是众多 热原物质中的一种，也是最主要的一种。
一般来说内毒素是热原,但热原不仅仅包括内毒素。 不是每一种热原都具有脂多糖的结构，但所有已知 的细菌内毒素脂多糖都有热原活性。在药品生产质 量管理规范（GMP）条件下，药品生产的质量控制 一般可以接受的观点是：不存在细菌内毒素意味着 不存在热原。
第三节 热原检查法
热原的定 义
热原（pyrogen）系指能引起恒温动物体温异常升高的致 热物质。
它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热 原及化学热原等。
这里所指的“热原”，主要是指细菌性热原，是某些细菌 的尸体及其代谢产物。大多数微生物都能产生热原，致热 能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆 菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也 能产生热原。它的化学结构是脂多糖和微量蛋白的复合物
新方法原理
外热原
人体（分泌内热原） 体温调节中枢
发热
细胞（分泌内 热原）
新方法主要以应用动物来源或人源细胞模拟人体，通过检测内源性热原（主要为细胞 因子，如IL-6、IL-1、TNF-α）在体外进行热原检测。
新方法国外研究现状
国外对新方法的研究始于20世纪80年代，国 际发达国家实验室，包括英国国家生物制品 检定所NIBSC、德国国家疫苗及血清研究所 PEI等，均对新的体外热原检测替代方法开展
热原的危 害
热原反应：热原进入机体后的数分钟至1小时内,突然 发冷、寒战、面色苍白、四肢冰冷、烦躁不安等症 状。持续时间约0.5~1小时。寒战消失后,随即高热,但 也有无寒战期而突然高热者。病人体温迅速上升,在 2~4小时体温上升至高峰,一般在39~40℃,严重者高达 41℃以上,病人面色潮红、头痛、恶心、呕吐。严重 者瞻妄、昏迷,甚至死亡。
实验动物的选 择
—
体重
性别
条件
饲养温 试验温
度
度
中国药 ＞1.7kg 不限，雌 使用7天预养期未见异常 17-25℃
典
兔应无孕 的未试动物，或已试的
符合热原规定的动物。
变化 ≤3℃
美国药 典
≥2.0kg
不限，雌 不使用3天内已试动物， 兔应无孕 不使用热原试验不合格
的动物。
20-23℃ 选定温 度
3.每隔30min按前法测量其体温1次,共测6次。
4.以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高度数， 当动物升温为负值时，以0℃计算。
初试结果判 断:
合格
复试
中国药 典
美国药 典
三只动物体温升高 均低于0.6℃，且 三只动物体温升高 总和低于1.3℃
三只动物体温升 高均低于0.5℃
三只动物出现体温升高高 于0.6 ℃ ，或者三只动物 体温升高总和高于1.3℃
±3℃
英国药 ≥1.5kg 不限，雌
典
兔应无孕
20-23℃ 变化 ≤3℃
— 时间 给药 测量次数 选择条件
中国药 3-7天
N
典
美国药 7天内 N 典
8次 30min/次
8次 30min/次
8次体温均在38.0-39.6℃ 之间，且最高与最低体 温相差≤0.4℃，个体间
体温差≤1℃
体温不超过39.8℃，个 体间体温差≤1℃
三只动物出现体温升高数 高于0.5℃
不合格
体温升高≥0.6℃的 动物数量超过1只
—
英国药 3只体温升高总
典
和≤1.15℃
1.15℃ ＜3只体温升高总和 ≤2.65℃
2.80℃ ＜ 6只体温升高总和 ≤4.30℃
4.45℃ ＜ 9只体温升高总和 ≤5.95℃
3只体温升高总和＞ 2.65℃
复试及结果判 断:
初 试
1.试验前至少1小时停止给食并置于适宜的装置中，使其适应试验环 境，饲养温度与环境温度相差≤±3℃。
2.每隔30分钟测量体温1次，一般测量2次（英国药典测4次，但前2 次舍去），两次体温之差不得超过0.2℃,以此两次体温的平均值作 为该兔的正常体温。当日使用的家兔，正常体温应在38.0～39.6℃ 的范围内，且各兔间正常体温之差不得超过1℃。两次体温的平均 值作为兔的正常体温。 2、测定其正常体温后15分钟以内，自耳静 脉缓缓注入规定剂量（10ml/kg）并温热至约38℃的供试品溶液.
新方法国内研究收录新热原检测 方法。 国家药典委员会已经启动了体外热原检 查法的课题.
已开展的研究方法
兔新鲜全血法 鼠新鲜全血法 人新鲜全血法 人冻存全血法 PBMC细胞法
感谢聆听！
第三组：王雅静、吴显婷、郭帅、祁 宇
时间：2017年4月