酶工程
第一章 酶的发酵生产
第一章 酶的发酵生产
第一节 酶生产的概述 第二节 菌种选择 第三节 产酶菌体的发酵 第四节 产酶条件的优化 第五节 发酵产酶动力学
第一节 酶生产的概述
按发酵方式分，可分为： 液态发酵 固态发酵 固定化细胞发酵 固定化原生质体发酵
提取分离法 酶的生产方法 生物合成法
在细胞生长和发酵产酶过得中，由于细胞的新陈代谢 作用，不断放出热量，会使培养基的温度升高，同时，
热量不断扩散和散失，又会使培养基温度降低，两者
综合，决定了培养基的温度
温度控制的方法一般采用热水升温，冷水降温，故此
在发酵罐中，均设计有足够传热面积的热交换装置，
如排管、蛇管、夹套、喷淋管等
(3)溶解氧的控制 培养基中的能源物质(一般是碳源提供)必须经有 氧降解才能产生大量的ATP。为此，必须供给 充足的氧气。 在培养基中生长和发酵产酶的细胞，一般只能 利用溶解在培养基中的氧气——溶解氧。 由于氧是难溶于水的气体，培养基中含有的溶 解氧并不多，很快就会被细胞利用完。为此， 必须在发酵过程中连续不断地供给无菌空气， 使培养基中的溶解氧保持在一定水平，以满足 细胞生长和产酶的需要。
异养 糖、醇、有机酸等 蛋白质及其降解 物、有机氮化物、 无机氮化物、氮 与碳源同 有些需要维生素等 生长因子 无机盐 水 自养 二氧化碳、碳酸盐等 无机氮化物、氮 氧化无机物或利用日 光能 不需要 无机盐 水
绿色植物 （自养）
二氧化碳 无机氮化物 利用日光能 不需要 无机盐 水
各种生物对营养的需求
(3)木霉(Trichoderma)
木霉属于半知菌纲。生长时菌落呈棉絮状或致密 丛束状，菌落表面呈不同程度的绿色。 木霉是生产纤维素酶的重要菌株。木霉产生的纤 维素酶中包含有Cl酶、Cx酶和纤维二糖酶等。 此外，木霉中含有较强的l 7α羟化酶，常用于甾 体转化。
四 酵母
（ 1）啤酒酵母 主要用于酿造啤酒、酒精、饮料酒和面包制造。在 酶的生产方面，用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱 氢酶等的生产。(氧化还原酶) 脱氢酶广泛应用与轻工业，如香料苯乙醇就是以苯 乙酮为原料由脱氢酶催化得到。
氮源
构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源 ） 氮源
有机氮源
无机氮源
蛋白胨、酵母膏、牛肉膏
铵盐、硝酸盐
需要注意合适的碳氮比（碳源代谢产物酸性，氮源代谢产物 碱性，配比不当会造成培养基酸化或者碱性化，不适宜菌体 生长）
无机盐
(1)参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性 (2)维持细胞结构的稳定性 (3)调节细胞渗透压 (4)控制细胞的氧化还原电位 (5)有时可作某些微生物生长的能源物质
(3)溶解氧的控制
一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越 长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性质， 主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。
控制 溶氧
调节通气量 调节氧的分压 调节气液接触时间 调节气液接触面积 改变培养液的性质
稳态扩散下单位时间内通过垂 直于扩散方向的单位截面积 的扩散物质流量（扩散通量） 与该面积处的浓度梯度成正比 即J=－D（dc/dx） 其中D：扩散系数，cm2/s，J： 扩散通量，g/cm2·s ，式中 负号表明扩散通量的方向与浓 度梯度方向相反。
胶束酶模型
胶束在水溶液中提供了疏水微环境，类似于 酶的结合部位，可以对底物束缚。 将催化基团如咪唑、硫醇、羟基和辅酶共价 或非共价连接或吸附于胶束上，可使其成为具 有酶活力的胶束模拟酶。
印迹酶
当模板分子(印迹分子)与聚合物单体接触时会形成多 重作用点，通过聚合过程这种作用就会被记忆下来。 当模板分子除去后，聚合物中就形成了与模板分子空 间构型相匹配的具有多重作用点的空穴，这样的空穴 将对模板分子及其类似物具有选择识别特性。 这是分子识别的基础，也是酶催化的基础。
三 霉菌
(1)曲霉(Aspergillus) 应用：是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。农业上用作 生产糖化饲料的菌种，因此是生产酶制剂（蛋白酶、 淀粉酶、果胶酶）的菌种。 生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。
(2) 根霉(Rhizopus) 代表种：米根霉。 根霉能产生一些酶类，如 淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等， 是生产这些酶类的菌种。在 酿酒工业上常用做糖化菌。 11a羟化酶 有些根霉还能产生乳酸、 延胡索酸等有机酸。
（2）模拟酶 主-客体酶模型（环状糊精酶）
胶束酶模型
分子印迹酶模型
环状糊精酶
α,β,γ-环糊精 系列分布在空腔两 侧的伯、仲羟基空 腔周边的羟基（结 合基团）与底物契 合容易达到有利配 置状态。 通过化学方法引入 催化基,建立电荷 和质子传递体系。 酶稳定性高，便宜， 但催化专一性和活 力差。
实验室的常用培养基：
细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）
放线菌：高氏1号合成培养基培养；
酵母菌：麦芽汁培养基；
霉菌：
查氏合成培养基；
同一菌，由于培养目的不同，使用不同，例如枯草芽 孢杆菌： 一般培养：肉汤培养基或LB培养基； 自然转化：基础培养基； 观察芽孢：生孢子培养基； 产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；
第三节 产酶菌体的发酵
二 发酵条件及控制 (1) pH值的控制
培养基---的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类 型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。为了维持培养基 pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，或在进 行工业发酵时补加酸、碱。
细菌与放线菌：pH7~7.5 酵母菌和霉菌：pH4.5~6范围内生长
水
水是微生物最基本的组成分（７０％—９０％） (1)水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动 (2)水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物） (3)调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）
碳源
(1)构成细胞物质或代谢产物中碳架 (2)碳源可作能源，为生命活动提供能量 常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白 质及其降解物 异养微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用） 选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制
一 细菌(1) 大肠埃希氏杆菌
大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅
速，而且营养要求低。
应用：大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁
殖大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌
工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶生产基因工程
工具酶
(2)枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 枯草芽孢杆菌是工 业发酵的重要菌种 之一。 生产淀粉酶、蛋白 酶 5’-核苷酸酶、某 些氨基酸及核苷。 水处理的聚合氨基 酸
(2)机械消泡 是靠机械装置实现的。其优点是勿需在培养液中加入 其它物质，从而减少了由于消泡剂所引起的污染和对 后续分离工艺的影响。 但机械消泡效果常不如化学消泡迅速彻底，同时机械 消泡也会增加培养装置的复杂性。
发酵生产酶的几种方式
固体培养发酵 制成固体或半固体的麸曲，经过灭菌、冷却后，接种产酶微 生物菌株，在一定条件下进行发酵，以获得所需的酶。适 合霉菌的培养和发酵产酶(霉菌有菌丝，液态发酵结块，且 固态发酵原料便宜,操作简单,但传递营养物质困难,产量相 对少)。 液体深层发酵 采用液体培养基，在生物反应器中，经灭菌、冷却后，接种 产酶细胞，、生产得到所需酶。(酶的产率高，质量稳定， 产品回收率高，是目前酶发酵的生产的主要方式。) 固定化细胞发酵 把微生物固定在水不溶性的载体上，进行多批次连续或间歇 发酵。这种发酵具有：细胞密度大，产酶能力高；发酵稳 定性好，可反复使用或连续使用较长时间；固定化细胞流 失较少，可在高稀释率条件下连续发酵；发酵液含菌体少， 利于产品分离。(额外成本高,须一定操作)
通常在生物学范围内每升高10℃，生长速度就加 快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物 来说，温度直接影响其生长和合成酶。
细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有所不同， 而月往往低于最适生长温度，这是由于在较低的温度 条件下，可提高酶的稳定性，延长细胞产酶时间。 在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳 定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产 量。
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微生物发酵方式的对比
（1）液态发酵产酶
（2）固态发酵
固态发酵和液态发酵的对比
固态发酵 原料价格 便宜 液体深层发酵 贵
原料浓度 水分需求 染菌 反应器体积 传热传质 发酵参数检测 产物回收 废水产生
高 少 不容易（水分少） 需求小 困难 不易 容易 少
低 多 容易 大 容易 容易在线检测 不容易 多
（2）假丝酵母 主要生产脂肪酶（南极假丝酵母，褶皱假丝酵母）， 尿酸酶 ，醇脱氢酶 17a羟化酶
第三节 产酶菌体的发酵
一 培养基
五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水
动物 （异养） 碳源 氮源 能源 生长因子 无机元素 水分
糖类、脂肪 蛋白质及其降解物 与碳源同 维生素 无机盐 水
微生物
细胞发酵产酶的最适pH值与生长最适pH值往往 有所不同。细胞生产某种酶的最适pH值通常接近 于该酶催化反应的最适pH值。
有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控 制培养基的pH值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。
(2)温度的控制
枯草杆菌的最 适生长温度为 34～37℃
黑曲霉的最适 生长温度为 28～32 ℃
生长因子 生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、 氮源物质进行合成，而必须另外加入少量的生长 需求的有机物质。 分类：化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤 （或嘧啶）及其衍生物和类脂成分 等四类 功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的 酶促反应 实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各 种生长因子的的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培 养基中本身含有各种生长因子