第二节 植物细胞培养产酶
植物细胞培养产酶 – 1902年，Haberlandt首次提出分离植物单细胞并 培养成植株的设想 – 植物细胞的全能性
Haberlandt
植 物 细 胞 培 养 产 酶
– 植物细胞培养产酶种类
产酶植物细胞 胡萝卜细胞 紫苜蓿细胞 糖苷酶 产酶品种
-半乳糖苷酶
过氧化物酶、酸性/碱性转化酶、糖化酶
植 物 细 胞 培 养 产 酶
2.获取植物细胞：愈伤组织诱导法（分散细胞） （利用细胞的全能性）
• 愈伤组织（callus） – 由外植体组织增生的细胞产生的团状不定型的疏散 排列的薄壁细胞群体；本意是指植物体的局部受到 创伤刺激后，在伤口表面新生的可帮助伤口愈合的 组织 • 诱导过程 – 配制半固体诱导培养基 – 灭菌、植入外植体 – 1～3周后继代培养
2.基因扩增加速酶的合成
• 通过增加基因的数量调节基因表达，可以发生在个体发
育某一阶段或细胞分化某一过程
• 细胞的一种应急方式
• 基因扩增可以由选择压力引起
– 耐药性细胞的抗药性产生
– 例：CHO 细胞为对抗氨甲基喋呤对二氢叶酸还原酶
的抑制，编码这种酶的基因急剧扩增
3.增强子促进酶的生物合成
• 增强子（modulator）—— 能高效增强或促进基因转录 的一段DNA 序列 • 增强子能促进同源或异源启动基因的转录活性，可高效
过氧化物酶、苯丙氨酸裂合酶 苯丙氨酸裂合酶 漆酶
甜菜细胞
大豆细胞 花生细胞 假挪威槭细胞 利马豆细胞 番木瓜细胞
-葡萄糖苷酶
木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶
大蒜细胞
菠萝细胞 剑麻细胞
超氧化物歧化酶
菠萝蛋白酶 剑麻蛋白酶
植 物 细 胞 培 养 产 酶
一、植物细胞的主要特点
体积较大：比动物细胞和微生物细胞都大 细胞生长速率和代谢速率低于微生物细胞，生长周期长 营养要求简单（较动物细胞） 细胞生长及合成次级代谢产物需要光照条件 对剪切力较敏感
– 有关微生物细胞中酶合成的调节理论也基本适用于
动植物细胞
– 动植物细胞具有比微生物更多的调节方式
• 转录水平调节
• 翻译水平调节 • 激素、神经调节
第一节 动植物细胞中酶生物合成的调节
1.细胞分化改变酶的生物合成 —— 端粒（telomere）
• 端粒是真核生物染色体的末端结构 • 由富含 G、T 的 DNA 简单重复序列不断重复而成 – 人端粒序列：……TTAGGG…… • 保护真核生物染色体免遭破坏 – 牺牲自我，填补 DNA 复制后在5’-端留下的空隙 – 端粒随细胞年龄的增长而逐渐缩短 • 端粒酶（telomerase）—— 催化端粒合成和延长 – 核糖核蛋白，其中的 RNA 部分含核苷酸模板序列， 可构建端粒重复序列 – 端粒酶一般存在于分化程度较低的细胞中
主要用于产天然产物、色素、香精等有机物（次级代谢物）
项目
大小（μm） 悬浮生长 营养要求
微生物
1-10 可以 简单
动物细胞
10-100 大部分附着 非常复杂
植物细胞
20-300 可以，易成团 较复杂
生长速率
代谢调节
快，0.5-5h
内部
慢，15-100h
内部、激素
慢，24-74h
内部、激素
环境敏感
植 物 细 胞 培 养 产 酶
2.获取植物细胞：直接分离法即直接从外植体中分离 （分散细胞）
• 机械法 – 将外植体捣碎，过滤或离心分离细胞 – 质壁未分离；细胞破碎率高，完整细胞数量少
• 酶解法
– 利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体，分离具有代
谢活性的细胞
– 能降解细胞壁，必须对细胞给予渗透压保护
半抗原诱导法
A. 酯酶的底 物 –酯 B.酯的羧基碳 原子受到亲核 攻击形成四面 体过渡态 C.设计的磷酸 酯类似物,作 为抗原去免疫 实验动物 磷酸酯类似物 免疫 (半抗原) 动物免 疫接种
免疫反应
对酯水解反应有催化 作用的单克隆抗体
酶蛋白诱导法（拷贝法）
用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动 物，并进行单克隆化，获得单克隆的抗体。对抗体进行筛选， 获得具有原来酶活性的抗体酶。 具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产生新酶。
三、植物细胞发酵产酶的工艺条件控制
（一）植物细胞培养的工艺流程
胚培养、器官培养、愈伤组织培养、细胞培养
1.外植体选择和处理
• 外植体（explant） – 从植株取出，经预处理后用于组织和细胞培养的植 物组织片段或小块 – 根、茎、叶、芽、花、果实、种子等 • 选择：无病虫害、生长旺盛、生长有规则 • 切片：0.5～1 cm • 消毒： – 70% 乙醇 – 5% 次氯酸钠 / 10% 漂白粉 – 0.01～0.1% HgCl2
细胞分化 剪切力敏感
能忍受广范围
无 低
非常敏感（无细胞壁）
有 非常高
能忍受广泛范围
有 高
传统变异、筛选
细胞或产物浓度
广泛使用
较高
不常使用
低
有时使用
低
二、植物细胞发酵的特点
– 优势 • 提高目标物的产率 • 缩短生产周期 – 木瓜蛋白酶：木瓜生长期8个月，木瓜细胞培养约1 个月 • 易于管理，不受自然因素控制 • 可以提高产物质量 – 通过严格的培养条件控制，减少植株病虫害和污染 – 缺点 • 培养条件要求高 —— 光照、剪切力影响显著 • 植物细胞生长缓慢 —— 相对于微生物
酶工程
动植物发酵产酶
第三章 动植物发酵产酶
第一节 动植物细胞中酶生物合成的调节
第二节 植物细胞培养产酶
第三节 动物细胞培养产酶
动 植 物 细 胞 培 养 产 酶
动植物细胞中酶生物合成的调节 – 从基因到蛋白质
复制
DNA
转录 逆转录
RNA
翻译 ？
Protein
பைடு நூலகம்
折叠
Active Enzyme
植 物 细 胞 培 养 产 酶
2.获取植物细胞：原生质体再生法（分散细胞） ---对于细胞质融合技术来说，这种培养方式更普遍
增强某些酶基因的表达
• 具有细胞或组织特异性，在不同细胞或组织中增强效果 不同
4.抗原诱导抗体酶的生物合成
抗体酶（abzyme）：催化性抗体，是具有 生物催化功能的抗体分子，是人工改造 的对抗体可变区赋予催化特性的特殊抗 体
抗体酶生产方法： 1）修饰法 在抗体与抗原结合部位引进催化基团 2）诱导法（主要方法） -半抗原诱导 -酶蛋白诱导