脑和脊髓微透析采样技术的理论、方法和应用1王云综述 1 岳云2史琳审校1首都医科大学附属北京朝阳医院麻醉科（100020）2比利时布鲁塞尔自由大学医学中心麻醉科1、概述全麻下中枢神经系统功能变化的研究是麻醉学领域内重要的课题之一，全麻下中枢神经系统的功能诸如学习和记忆、感觉和运动、觉醒与无意识等的变化与神经元之间的信息传递有着极大的关系。

而神经元之间的信息的传递是以递质分子的释放、识别和灭活为基础的。

神经细胞间隙是神经元之间传递信息的主要场所，因此了解全麻下中枢神经系统活动机理，必须对神经细胞间隙中的化学物质进行动态监测。

传统的神经化学的研究大多是对离体脑组织的分析，这些离体分析方法所提供的通常是一种静态的、混杂的结果，包括了细胞器、细胞浆及细胞外液中成分的总和。

随着认识的深入和材料科学的进步，人们在推挽灌流基础上发展了的微透析技术，再加上微量递质检测技术的飞速发展，使得活体动物神经递质的在线测量成为可能，从而使行为学的研究与中枢神经系统相应区域的神经递质的释放相联系起来，有利于更深层次地揭示整体动物神经活动过程中的化学调控规律。

目前，此技术已成为研究全麻下神经化学特别是神经递质和神经肽的重要手段，并开始应用于疼痛的脑和脊髓机理的研究，临床上亦有使用该技术监测脑代谢的报道。

2、脑和脊髓微透析的原理2．1原理微透析是监测活体组织细胞外化学物质变化的一种技术，它以小分子物质和水能通过半透膜顺浓度梯度扩散的原理为基础。

将透析膜植入特定区域，用组分和理化性质类似于相应组织细胞外液的溶液进行持续灌流，当待测物质的浓度在透析膜一侧较高时，这些物质就会顺浓度梯度进行扩散。

由于灌流的持续进行，透析管内的液体不断的流动更新，因此跨膜浓度梯度始终存在。

通过不断收集一定量的灌流液测定其中的待测物质的含量，从而达到对该物质的动态监测。

2．2回收率（recovery）微透析探头的透析效能可以它对待测物质的回收率来表示，通过比较透析液和探头外介质中待测物质的浓度可以确定该物质的回收率。

相对回收率（relative recovery）是指透析液中物质浓度与透析探头外介质中该物质浓度的比值。

它与灌流液的流速成反变关系，当流率接近零时，相对回收率可接近100%。

相对回收率通常以百分数表示。

绝对回收率（absolute recovery）是指用不含待测物质的灌流液灌流时，单位时间内进入透析管并从透析管内流出的该物质的总量。

它在一定范围内与灌流液的流速成正变关系，当流率为零时绝对回收率也为零。

2．3定量方法在微透析实验中，了解神经递质在探头外介质中的实际浓度不是必不可少的。

人们更感兴趣的是某种药物或行为操作所引起的神经递质及其代谢产物的变化趋势（增加或减少），这种变化可用给予药物或操作后透析液中该物质的浓度相对于基础状态（随实验设计而定）下透析液中的浓度的百分数来表示。

这种定量方法是目前微透析研究中应用最多的定量方法，简单明了且能说明问题。

3、微透析下影响神经递质释放的离子因素微透析技术作为一个研究在体神经递质释放的方法，其前提假设是细胞外物质浓度准确地反映了突触部位的物质浓度。

问题是一种神经递质的细胞外浓度不仅仅受神经元突触末梢释放的影响，还受酶降解、递质弥散和递质的再摄取的影响。

而且，神经胶质细胞也可释放神经递质并且不受Ca2+的影响。

因此，透析液内神经递质的浓度并不完全反映突触神经递质的释放。

许多学者对此进行了对照研究，认为实验因素如疼痛、药物等所诱导的透析液内神经递质水平的变化至少可以部分反映突触的释放。

他们的研究还认为离子如K+，Na+，Ca2+等因素对透析液内神经递质的水平影响较大。

透析灌流液内的高K+是诱发神经递质释放的重要因素。

高K+灌流液内的K+能透过透析膜进入组织使细胞去极化，导致递质的释放。

开放Na+通道的神经毒素藜芦定（veratridine）也可刺激神经递质的释放。

Na+通道阻断剂如河豚毒素（tetrodotoxin）可减少神经递质的释放或阻断刺激所诱发的神经递质的释放。

除了某些氨基酸呈电压依赖性释放（与Ca2+机制无关）外，经典的神经递质均为Ca2+依赖性囊泡释放。

采用低Ca2+高Mg2+的灌流液灌流将减少透析液内递质的水平（Mg2+可通过与Ca2+竞争运输和结合而阻断Ca2+通道）。

从灌流液中去除Ca2+并加入Ca2+通道阻断如维拉帕米等，自发性释放、药物和K+刺激所诱发的神经递质的释放都将减少，由此可证明经典神经递质的囊泡释放理论。

然而，由于技术的限制（基础水平接近于检测限）、非囊泡释放和神经胶质细胞源性的递质的释放等，神经递质的Ca2+依赖性自发释放很难得到证实。

4、设计微透析实验的注意事项4.1探头的类型、性能和选择神经麻醉学领域多为脑和脊髓微透析实验，使用的探头为同心圆型或线形，瑞典CMA 公司和美国BAS公司生产多种类型的实验用探头。

另外，该公司还可按客户要求制造特殊的探头。

BAS公司还生产线形和环形探头可供脊髓微透析使用。

线形探头的透析膜在中间，可用于清醒自由活动大鼠脊髓背角微透析。

环形探头的透析膜在中间并呈环形，常用于麻醉或清醒自由活动大鼠鞘内脑脊液微透析。

微透析实验前必须先确定实验的待研究部位如脑或脊髓、待研究部位的空间大小、待测物质的分子量大小、待测物质在透析液内浓度的数量级等，以便选用探头。

一般在满足实验要求（如空间分辨率和所测定物质等）的情况下，尽量选用膜长较长（回收率高）、杆和膜径较细（组织损伤小）的探头。

4.2 灌流液成分和灌流速率为使灌流成分不影响生理或实验情况下神经递质的释放，灌流液通常选用生理液如林格氏液或人工脑脊液（ACSF）。

灌流液成分如K+，Na+，Ca2+，Mg2+和pH对物质的回收率有较大的影响，理想的灌流液应尽可能接近细胞外液。

灌流速率与相对回收率成反变关系，与绝对回收率成正变关系。

流率越低，透析液中的物质浓度越高。

透析实验使用的灌流速率一般在0.5-10µl/min之间。

脑微透析通常使用的灌流速率为2µl/min，脊髓微透析通常使用的灌流速率为5µl/min。

每次透析样品收集的容量与所研究物质的检测方法以及实验所需的时间分辨率有关。

当使用高效液相（HPLC）等检测待测物质时，对样品的收集量要求较低，可收集较少的容量如10-20µl以提高实验的时间分辨率；当分析仪器灵敏度较低，实验对时间分辨率要求不高时可尽量收集较多的样品，以提高检测的响应值。

一些肽类物质如P物质和降钙素基因相关肽等在透析液中的浓度较低，常采用放射免疫法（radioimmunoassay, RIA）或酶联免疫法（enzyme immunoassay, ELISA）检测, 这些检测方法对待测物质的绝对量的要求比浓度高，可在满足实验所需的时间分辨率的前提下通过提高灌流速率和延长收集时间达到。

4.3 增加透析液内物质的检出率的策略由于透析液内神经递质的基础水平往往接近于分析仪器的检测限，因此实验中得到一个稳定的神经递质的基础释放值并不容易。

乙酰胆碱释放后易酶解破坏、单胺类物质释放后易被突触前膜再摄取或者在透析过程中氧化分解、神经肽类因物质分子量较大而回收率较低，这些因素导致透析液中的这些物质的检出难度较大。

为提高这些物质的检出率，学者们提出了一些有价值的策略。

5-HT易被再摄取和单胺氧化酶氧化，当透析液内的5-HT和吲哚不能检出时，在灌流液内加入再摄取阻断剂和氧化酶抑制剂，可使它们达到可检出的水平。

但是，再摄取阻断剂能改变神经递质释放的药理学机制，使获得的结果的解释更加复杂化。

乙酰胆碱释放后易被胆碱酯酶分解，检测乙酰胆碱时灌流液中常加入胆碱酯酶抑制剂。

单胺类神经递质易被氧化，收集样品时可在收集管中预先加入抗氧化剂如抗坏血酸、高氯酸、冰醋酸等。

单胺和氨基酸递质在细胞外的水平为nmol范围，而神经肽类的细胞外水平为pmol水平。

为检测神经肽的在微透析液内的基础水平，常需在灌流液内加入肽酶抑制剂。

然而，即使加入了肽酶抑制剂，神经肽的基础水平也往往测不到。

微透析技术的非常差的时间分辨率（如样品的收集常需10-30min）妨碍对神经递质的短时脉冲式释放的检测。

但是对于神经肽来说，其释放后的清除明显较慢且大多释放后通过空间的传递发挥作用，微透析时间分辨率差的特点对神经肽的检测影响并不大。

4.4 微透析探头在脑内产生的组织和生物化学变化探头的损伤、炎症反应及随后的胶质细胞的增生，均可引起局部脑代谢和脑血流量的急剧变化。

探头植入后，其邻近区域脑组织糖代谢增强、脑血流下降，24h后才可恢复正常。

根据这一观察，开始微透析的时间应在24-48h间。

然而，实际实验中通常在探头植入后1-4h 就开始了微透析实验。

探头植入后第3天，可观察到星形胶质细胞的肥大和神经轴突的顺行和逆行退化。

在2周以后，星形胶质细胞可由结缔组织逐渐替代。

这些变化使得慢性微透析（探头植入后2-3天）成为学者们争论的问题之一。

影响慢性微透析的可能因素主要包括组织学变化引起的脑组织生化变化、探头外面的炎性细胞和结缔组织以及血脑屏障完整性的变化等。

目前的研究认为，探头植入后短期内进行微透析实验其结果可以反应脑细胞外液的变化，但慢性微透析实验的可靠性仍值得进一步研究。

5、脑和脊髓微透析的方法学5.1 脑微透析技术脑微透析是最常用的微透析技术，目前已可进行皮层、海马、脑干的某些区域、中脑导水管周围灰质、甚至某些核团的微透析。

5.1.1 动物的准备在神经麻醉学领域多采用SD大鼠200-300g。

首先在大鼠脑立体定向图谱上寻找所要研究的脑区的坐标。

将动物用5%的水合氯醛麻醉（300mg/kg）后，置于立体定向仪上，上耳棒、牙托，下垫温毯，经肛门植入温度计监测体温，自动加温仪设置温度37.4℃。

切开头皮，根据坐标位置在颅骨上钻孔，小心操作尽量不损伤硬膜。

在立体定向仪下旋转垂直臂将微透析探头导引管植入目标脑区。

用调好粘稠度的牙托粉将探头导引管固定，牙托粉变得坚硬后可稍加缝合大鼠头皮，并肌注青霉素3000U/ 天。

5.1.2 脑微透析实验操作脑内埋置透析导引管的大鼠恢复3-5天后，如伤口愈合良好、活动状态佳、无神经损害症状，并且与实验者有一定的“感情基础”后即可用于实验。

实验前应仔细准备微透析系统。

将大鼠透析导引管内芯取出后，左手握鼠，右手拇指和食指夹住探头在大鼠合作的情况下将探头植入导引管抵达目标脑区。

给大鼠围上脖夹，连接清醒系统仪器即可进行透析工作。

值得注意的是，由于探头插入对脑组织的损伤会诱发神经递质的释放，必须冲洗60-90min 后才能开始微透析液的收集工作。

一般在连续收集三个基础样品经检测物质的浓度稳定后，才可开始实验。

为防止透析液内物质的分解氧化，探头的出端管道应尽量短，收集小管应置于低温收集器或冰盒内。