2.自由活动实验（慢性实验 chronic preparation） 用 pentobarbital 或 halothane (0.15% halothane/air mixture, air mixture: 95% O2 + 5% CO2)麻醉
需要液体转动轴，动物在自由运动的情形下，不 受限制地收集透析液 需要适当的动物活动室(动物行为合乎生理状况, 如隔音、保温、保湿、光控等)
目前我们虽知透析液中钙离子的含量，对单胺的 释出有影响，但影响的程度则未知。组织间的不 同差异，钙离子可能是一个影响因素。
五、微透析实验操作
（一）透析探针的植入 1.必须的仪器：外科器械、钻孔机、立体定位仪 2.定位软件、图谱： Paxinos, G., and W. C. (1997) The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (The Third Edition): San Diego, Academic Press. Paxinos, G., and F. K. B. J. (2001) The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates (The Second Edition): San Diego, Academic Press.
Halothane麻醉恢复快又比较不会发生意外,但要 求小动物麻醉机
六、微透析实验的注意事项
（一）组织损害 脑组织急性植入小导管或探针，导致立即地，但 数分钟到数小时内可恢复的变化，如在探针邻近 区域， • 组织被压凹， • 血脑障壁被破坏， • 葡萄糖代谢受影响， • 神经元损害
（二）慢性实验过程 微透析探针植入几天，透析膜附近的组织，立即 发生神经胶质（gliotic）反应，结果造成炎症细胞 和结缔组织覆盖在半透膜上，形成障壁（barrier） 阻碍透析进行。例如： 探针植入后几天，基本的单胺释出和药物引起的 单胺释出都会下降
③
Freely moving rats
Dialysis probe Area of diffusion
二、微透析技术原理
微透析探头是由具有一定截留分子量的纤维半透 膜制成(microdialysis probe，MDP)； 将探头埋入待测的组织区域，以恒定速度向探头 内灌注与组织液成分相近的等渗灌流液；
（六）透析液中钙离子的浓度
大多数微透析使用的透析液，都含有 1-3.4 mM 浓度的钙离子。
动物组织不同区域，钙离子浓度从1-3 mM 不等。 透析液中含有3.4 mM 和含有1.2 mM 钙离子时， 对 药 物 引 起 的 DA 变 化 ， 会 有 定 量 的 （quantitative）不同。
3.在线收集与检测 (Online) 将探针出口直接连到 HPLC 的承载阀（load-valve） 上，而直接在线上自动分析透析液。即把一台 HPLC 限制在单一动物身上，使透析实验全自动化
（五）灌流液 (perfusate)
1. Ringer's solution：
• 147 mM Na+ • 4.0 mM K+ • 2.0 mM Ca2+
微透析系统示意图-Anesthesized rats
Anesthesized rats
微透析系统示意图- Freely moving rats
②
④ ①
Perfusion medium: aCSF Flow rate: 2 l/min
③
Freely moving rats
Dialysis probe Area of diffusion
（二）微透析探针植入前的准备 1.手术前，将透析探针（储存在干的状态下）连 上透析系统，并安置在立体定位仪的把手。
2.将把手夹在一个小蒸馏架上，将探针浸到含有 透析液的烧杯中，使透析膜完全浸湿和微微张 开。一旦透析膜弄湿后，就不可将透析膜移出 溶液，因为透析膜干掉后，会影响单胺的回收 率。 3.检查透析膜，确定它是流通而不渗漏的；并排 空系统内气体。
2. 人工脑积液 (artificial cerebrospinal liquid, aCSF)
• 140 mM NaCl • 3.0 mM KCl • 1.2-3.4 mM CaCl2 • 1.0 mM MgCl2
• 1.2 mM Na2HPO4 • 0.27 mM NaH2PO4 • 7.2 mM glucose • pH 7.4
（三）透析液转换器 Carnegie Medicine 公司发展了一个全自动的透析 液转换器 CMA/110 及 CMA/111。因这个机器有 微调的功能，马达驱动的设备，来转换透析液， 在转换过程中不会让空气进入。
（四）透析液收集
1.手动收集透析液 虽然耗时间，但可使一台 HPLC 发挥最大功用。 例如收集时间要 20 分钟，测定一个样品只要 7-8 分钟，则一台 HPLC 力足以应付 3 种样品； 使样品分离和分析很明确 2.自动收集器 (CMA/140) 按一定间间隔将透析液收集在冷藏（ refrigerated ） 设备的旋转盘上的玻璃小瓶内 , 这就不需在实验 过程中一直看守着仪器。但就无法一边收一边分 析透析液
当灌流液流经探头前端透析膜时，组织内小分子 量生物活性物质即顺浓度梯度从膜外扩散入膜内， 并随灌流液被引流至探头外；
按一定的时间间隔连续收集透析液，检测其中待 测生物活性物质水平，可监测该区域内细胞外生 物活性物质浓度的经时变化过程
微透析技术原理优点
组织损伤小、取样少、方 便、快捷、可连续监测且 易实现自动化等优点。
微透析技术特点(续）
检测方法： --单胺类物质测定主要采用高效液相色谱 (HPLCECD 法； --氨基酸类物质多用 HPLC-荧光法测定； --乙酰胆碱、乳酸、抗坏血酸、丙酮酸和嘌呤 类等物质多采用 HPLC-紫外检测法； --神经肽类物质主要用放射免疫法测定。
四、透析相关仪器及透析液
（一）微透析探针 组成成分：小口径的透析膜、硅管、防水万用胶、 硅胶毛细管
1.橡胶管； 2.硅胶管（silica tubing）粗管； 3.硅胶管（silica tubing）细管； 4.聚乙烯管(PE-10 (polyethylene tubing)； 5.透析膜（Dialysis membrane）； 6.环氧乙烷（epoxy adhesive）； 7.注射针头。
（二）透析泵 1.流速稳定且缓慢，介于 1-5μl/min
三、微透析技术特点
MDP：常用管式半透膜与不锈钢、石英或塑料毛 细管构成，半透膜由再生纤维素、聚碳酸脂或聚 丙烯腈制成。截留分子量 5,000-100,000 dolton 不等。适合神经递质等小分子物质通透，而蛋白 质难以通透 ； 灌流液：脑微透析的灌流液一般采用人工脑脊液 (artificial cerebra液；
2.快速的前进/后退模式，连续而可调整的流速， 和微调控制选择（microprocessor control option）
3.液体转动轴（liquid swivel）:动物可自由行动， 不会被透析管缠住
4.常用透析泵 CMA/100, Harvard Microliter , Sage Model 341A
无论是术后 4 天纹状体的 DA,还是术后 7 天海 马回的 5-HT，其基本的释出量仍都与钙离子相关， 暗示它们都源自神经元
HPLC-ED 分析单胺及其代谢物实验。(A)单胺及其代谢物标准品。(B)纹 状体透析液。1. norepinephrine; 2. epinephrine; 3. dopamine; 4. DOPAC; 5. 5-HIAA; 6. HVA; 7. 3-MT(3-methoxytyramine); 8. 5-HT.
微透析技术与方法
洪宗元 皖南医学院定量药理研究所
微透析技术
微透析技术是一种微量
化学采样与检测技术

微透析系统组成 微透析技术原理 微透析技术特点 透析相关仪器及透析液 微透析实验操作 微透析实验的注意事项
一、微透析系统组成
② ④ ①
Perfusion medium: aCSF Flow rate: 2 l/min
（三）麻醉 1.非复原性（急性实验 acute preparation） 用 chloral hydrate 或 urethane麻醉，麻醉时间较长
实验进行中，用加温毯或台灯将动物体温维持在 37 °C。
手术（30min），然后等 2 小时作基础值测定期 （baseline period）,看(单胺释出量)有否趋于稳定， 然后药物注射之后，继续测定 2 小时左右的给药 测定期（post-drug）。