题目：秀丽线虫生殖细胞凋亡检测
实验目的:
1. 掌握检测凋亡细胞的方法
2. 学习使用荧光染料活体染色的方法和步骤
．实验原理
1. 秀丽隐杆线虫( Caenorhabditis elegans )：是一种无毒无害、可以独立生存的
线虫。
其个体小，成体仅 1.5mm 长，为雌雄同体 ( hermaphrodites )，雄性个体仅占群体的 0.2%，可自体受精或双性生殖；在20℃下平均生活史为 3.5 天，平均繁殖力为 300-350 个；但若与雄虫交配，可产生多达 1400 个以上的后代。
1976 年， Sulston 和 Horvitz 利用秀丽隐杆线虫 ( Caenorhabditis elegans ) 研究发现，其约 13%的体细胞在胚胎发育中注定死亡，使得人们认识到细胞凋亡的遗传基础。
2. 荧光染料活体染色：本实验使用吖啶橙( Acridine orange )作为染色剂，该染
料对细胞具有慢性毒性，致癌性强，由于凋亡细胞因 DNA片段化可结合更多染料，荧光显微镜下呈亮绿色，可在荧光显微镜下快速方便的检测出，适用于多数品系。
实验材料及设备
1. 实验材料：
a) 各品系秀丽隐杆线虫：N2(实验组) , ced-1::gfp (方法对照组)，ced-
3(阴性对照)
b) OP50
c) M9培养基
d) NGM培养基
2. 实验设备：
a) 普通光学显微镜
b) 载玻片若干，盖玻片若干，铂金丝
c) 暗箱
d) 吸水纸、滴管等
e) 荧光显微镜
四．实验方法及步骤
1. 线虫接种、同步化
2. 取样：在 12 孔板培养板上，每孔吸取 900μL 预先接入少量 OP50 的 M9
培养基，每孔用铂金丝挑取培养 20~30 条成体线虫
3. 染色：向 N2与 ced-3 品系中每孔加入 250μg/mL 吖啶橙 100μL, 混匀后
置于培养箱(避光)染色 45~60min。
4. 方法对照组观察：向 ced-1::GFP 品系中加入 1 滴盐酸左旋咪唑，麻痹线
虫后在荧光显微镜下观察。
5. 恢复：将已染色的线虫吸出置于 35mm培养基中，恢复 45~60min ，使
摄入的含染料的 OP50排出。
麻痹线虫并置于荧光显微镜下观察。
6. 观察：上述三个品系用相同方法观察：蓝光激发，在 20 倍物镜中，凋亡
细胞位于生殖腺臂弯转弯附近，呈亮黄色（染色时间长）或亮橙色（染色时间短）（ced-1::GFP 组凋亡细胞呈亮绿色），未凋亡细胞核为均匀的暗绿色。
五．实验结果
一）方法对照组：
图1 方法对照组荧光显微镜观察结果
在方法对照组中可观察到GFP 蛋白标记的凋亡细胞的阳性结果：在生殖腺臂弯转弯附近有亮绿色的空泡，外沿颜色最
深，内侧颜色浅，该品系无需染色，发出绿色荧光的是标
记ced-1 蛋白的GFP蛋白，会聚集在凋亡细胞细胞膜上。
二）实验组：
图2 实验组荧光显微镜观察结果
在实验组中能观察到吖啶橙标记的凋亡细胞的阳性结果：呈现亮橙色的细胞结构，在20 倍物镜中，凋亡细胞位
于生殖腺臂弯转弯附近，呈亮黄色（染色时间长）或亮橙色（染色时间短），未凋亡细胞核为均匀的暗绿色。
三）阴性对照组：
图3 阴性对照组荧光显微镜观察结果
由于ced-3 为凋亡基因缺陷品系，所以在阴性对照组中理论上不可能观察到凋亡细胞的阳性结果，但是在结果中
仍然可以看到呈现亮橙色的细胞结构，有两种可能：1. 受损
死亡的细胞2. 染色时间过长，吖啶橙杀死细胞，产生假阳
性结果。
六．实验讨论
1. 实验结论：
本实验使用吖啶橙或 GFP 蛋白标记凋亡细胞，使其在荧光显微镜下显示为亮绿色
2. 讨论一：实验中有哪些注意事项？
1. 吖啶橙有较强毒性，长时间使用吖啶橙染色会导致细胞死亡，染色超
过 90min 会增加假阳性。
2. 吖啶橙有毒性，实验过程中严禁直接接触皮肤，取用吖啶橙需要在实
验室专门的区域，所有接触了吖啶橙的实验器械都要集中处理。
3. 在取用线虫时，动作要轻缓，防止伤害线虫，如果确实感觉难度太
大，可以向培养基中加入少量无菌水或培养基，然后用吸管吸取含有
线虫的液体以吸取线虫。
3. 讨论二：如何设置阳性对照？
答：线虫研究的常用品系还包括 ced-1 与 ced-5 ，这两个品系的特点
是，因此，如果使用这两个品系作为阳性对照，可以很容易的在荧光显微镜下观察到凋亡细胞。
4. 讨论三：ced-1::GFP 组的作用是什么？
答：该组为方法对照，作用是证明本次实验所用的吖啶橙标记凋亡细胞的方法准确可靠， CED-1 是跨膜蛋白，在 lim-7 启动子作用下，在鞘细胞表达，在凋亡过程中， CED-1::GFP 蛋白簇聚于凋亡细胞周围，不需要染色，但用于其它品系需要进行遗传操作。
七．参考文献
[1] DOS REMEDIOS CG, CHHABRA D, KEKIC M, et al. Actin binding proteins: regulation
of cytoskeletal microfilaments.[J]. 2(2):433-473
[2] 翟中和，王喜忠，丁明孝等.《细胞生物学》[M]. 高等理科教育，
2004(1):123- 128.
[3] 刘雪兰, 孙菲菲,李培英, 等. 寄生虫基因功能研究的模式生物-秀丽隐杆线虫[J]. 中国兽医杂志,2011,(8):63-65. DOI:10.3969/j.issn.0529- 6005.2011.08.025.。