细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。
基因组DNA 断裂时，暴露的3'-0H 可以在末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal Deox yn ucleotidyl Tran sferase,TdT）的催化下加上荧光素（FITC）标记的dUTP（fluorescein-dUTP），从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL 法检测细胞凋亡的原理。
TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂（和细胞凋亡时的断裂方式不同）。
这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把
射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。
针对问题2（TUNEL法的实验原理是什么？）：
基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dUTP进入细
胞内，在rTDT的辅助下dUTP与核断裂的DNA 3 -0H结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dUTP 上的biot in 结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biot in 分子），最后用DAB
过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情
况。
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1. TUNEL工作原理：简单说就是一一TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是；生物素（biot in ）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT En zyme）的
作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3' - 0H末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的
链霉亲和素（Streptavidin-HRP ）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通
显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-0H形成，很少能够被染色。
针对问题3 （TUNEL实验中几个关键步骤是什么？）：
1. 充分脱蜡和水化。
脱蜡可以先60度20min，再用二甲苯两次5~10min ;而水化用梯度乙
醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀；
2. 把握好细胞通透的时间。
一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10~30min,
几um切片用短时间；几十um切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和
抗体进入胞内。
3. 适当延长TUNEL反应液的时间。
一般是37度1h,你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2h,但要结合你最终的背景着色。
4. DAB显色条件的选择。
一般DAB反应10分钟左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过
30min;我不喜欢用promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色。
5. PBS的充分清洗。
我个人认为，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加
次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。
6. 此外，内源性POD的封闭也十分关键。
对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经
验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的
特异性染色。
针对问题5.细胞通透的原理、通透剂的浓度、孵育时间及其配制方法？
1. 蛋白酶K是消化膜蛋白，从而起打孔作用，增加
膜通透性，使rTDT酶、抗体易透过细胞膜进入细胞反应；一
2. 蛋白酶K一般工作液浓度为20ug/ml,但浓缩液可配制1~10mg/ml，可用PBS配制，也可用蛋白酶K缓冲液（100mM Tris HCl PH8.0+50mM EDTA ）;
3. 蛋白酶K反应时间一般为10~30 min，具体时间长短与切片厚薄有关，4um左右的片子可以用10 min，但30 um左右的可用30 min，最终通过摸索最佳时间。
过长易脱片、过短起
不到通透效果。
1. 抗原修复的原因是标本在甲醛等固定过程中，因发生蛋白交联和甲醛的封闭作用使抗原性降低，可以通过抗原修复使抗原决定族充分暴露出来；
2. 免疫组化中经常使用抗原修复，因为它的原理主要是抗原和抗体反应，通过抗原修复使更多的抗原与抗体结合，避免假阴性结果；
3. 而TUNEL的原理是dUTP与断裂的DNA上的3 '0H结合，故不需抗原修复；
4. 第一次TUNEL反应只需37度反应1h,或者延长时间即可
1. PROMEG公司去年是40t要3300元（按100ul/片，实际可根据切片大小，加到30ul/pian ）；而roche公司一般10t国内分装1300元（同样也是100/pian ）；
2. 两个公司试剂盒内均没有PBS试剂，也不含DNase（以制作标准对照片）；
3. 我一般用4%PFA多聚甲醛，至少浸泡24 h后进行石蜡包埋、制片。
此外，Promega公司在操作步骤中加了两步4%PFA以固定组织，试剂盒内无PFA但提供了配制方法。
再次请教：
1. 我做TUNEL M染用苏木素几秒钟，请问还用不用 1 %盐酸究酒精分化了？
2. 我想用罗氏的TUNEL式剂盒做荧光显像，请问用什么封片，配方？针对你的问题，我分析如下：
1. 盐酸酒精分化的目的：一方面是分色；另一方面是减弱过强的苏木素核染色。
所以你若把握好苏木素着色，也可不分化。
2. 分化时间不能过长，否则阳性着色也褪色。
3. 一般荧光成像后可用高纯度甘油封片即可，若需长期保存，也可用无色指甲油片周围封固（必要性不大）。
这是我的操作步骤（Promega公司），看完后就知道了：
1. 脱蜡：用二甲苯浸洗5 min X2次；
2. 水化：用梯度乙醇（100%x 5 min、100%x 3 min、95%x 3 min、85%x 3 min、70%
x 3 min、50 %x 3 min ）；
3. 浸洗：0.85 % NaCl x 5 min PBS 洗5 min ；
4. 固定：浸入4%多聚甲醛15 min ；
5. 浸洗：PBS 5 min X2 次；
6. 细胞通透：用每片100 ul 20 卩g/ml Protein ase K 处理组织15 （10~30）min RT ；
7. 浸洗：PBS洗5 min ；
8. 固定：浸入4%多聚甲醛5 min ；
9. 浸洗：PBS 5 min X2 次;
10.平衡：加100 ul平衡液，湿盒平衡10 （5〜10）min ;
11.制备TUNEL反应混合液: 处理组用1卩l rTdT + 1卩l生物素标记的dUTP+ 98 ul 平衡液混匀；而阴性对照组不加rTdT，改为三蒸水；阳性对照组先加入100卩l DNase1缓冲液孵育5 min，甩掉液体后再加100 ul DNase 1 （10 U/ml ）酶切10 min，用去离子水冲洗4次, PBS浸洗5 min，后面步骤从第10步开始。
12.标记反应：加100卩l TUNEL反应混合液于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中
反应37°CX 1 h。
13.终止反应：浸入2X SSC 15 min；
14.浸洗：PBS 5 min X3 次；
15.封闭POD 浸入0.3 % H2O2 15 min ;
16.浸洗：PBS 5 min X3 次；
17.酶标反应：加100 ul streptavidin 标记HRP （按1:500 PBS 稀释）30 min ；
18.浸洗：PBS 5 min X3 次；
19.DAB显色（避光）：力口100 ulDAB混合液（50 ulDAB+50 ulDAB 底物缓冲液+ 50 ul
H2O22Q<+ 950 ul 三蒸水）10min左右，镜下出现浅棕色背景时。
20.用去离子水冲洗几次；
21.用苏木素复染，3 s左右后立即用自来水冲洗。
梯度酒精脱水（50、70、85、95、100、100%各1 min ）、二甲苯透明1 min X2次、中性树胶封片。
1、蛋白酶k的目的是通透细胞膜和核膜，从而使反应试剂充分进入细胞核进行反应，提高阳性率。
但浓度过高或孵育时间太长容易脱片，只要不脱片，好像影响不大，其作用类似与Triton X100等细胞通透剂。
2、蛋白酶K浓度配成贮存液浓度1mg/ ml是可以的，好像工作液浓度是20ug/ml吧，然后
分装成小份，用完一支再用下一支，-20度保存1个月应该没问题的（重复拿的那支），而一直冷冻的至少半年以上（我试过。
的）。