移植部位
• 原位移植（orthotopic implantation） • 异位移植(ectopic implantation) 皮下、 肾包膜下、腹腔
可移植性肿瘤的参考标准
• 传15-20代以上 • 接种成活率100%，自发消消退率<5% • 生长速度稳定 , 宿主寿命稳定 , 宿主反应 低下 • 瘤组织的组织结构与原发瘤相似，保持 原发瘤的特性和标志
转移模型
• 自发转移模型 (spontaneous metastasis) ：肿 瘤细胞穿过宿主自然屏障，侵入血道和淋巴道 而发生的转移，常用同种移植瘤和人肿瘤原位 移植瘤，后者反映人肿瘤细胞与宿主器官的相 互作用，可用于辅助治疗的研究 • 实验性转移模型 (experimental metastasis) ： 人工方法将癌细胞移植于血道和淋巴道而发生 的转移 • SCID-Hu 鼠模型: 将人胚器官如肺、骨髓等移 植于 SCID 鼠皮下，建立癌细胞对靶器官的移 植模型
培养条件
基本营养成分 RPMI1640 DMEM (Dulbeccos modified Eagle medium) 谷 氨酰胺 生长因子 小牛血清 胎牛血清 灭活补体 56℃ 30min 环境 37℃ pH 7.2-7.4 渗透压 无污染无毒 细菌、支原体
体外培养的优点
优点：1.活细胞， 2.对象均匀，易控制实验条件，易于观察和纪 录实验结果 3.易研究单个细胞的结构和功能，易于进行分 子生物学水平研究， 4.实验周期短，成本低，细胞系可长期保存。
实验动物基础知识
法
规
• 1988年 中华人民共和国实验动物管理条例 • 1989年 医学实验动物管理实施细则 • 1994年 关于在全国医疗卫生系统实行实验动物合格 证制度得通知 （医学实验动物合格证书，医学实验 动物环境设施合格证书，医学实验动物全价营养饲料 合格证书，医学实验动物饲料生产条件合格证书）
• 1988年 广东省实验动物管理办法
基本概念
实验动物（laboratory animal）:指人工培育的、 对其携带微生物实行控制、来源清楚、遗传背 景清晰、可用于科学实验得动物。 实验用动物（animal for research）:能用于科 学实验的动物，包括实验动物、野生动物、经 济动物和观赏动物。 标准化实验动物：有明确的遗传背景、繁殖方 法、饲养环境、饲料成分均达到标准的实验动 物。在科学研究中必须使用标准化实验动物。
• 简单易行、易重复 • 选择对特定致癌物敏感的动物种系： 多 环 方 香 烃 - 皮 肤 / 小 鼠 ； 甲基卞肼亚硝胺-食道癌/大鼠； 甲基氨基偶氮苯-肝癌/大鼠 • 恰当的致癌物剂量： 动物存活率高，诱 发周期短。 • 诱发的肿瘤类似于人类肿瘤
• 原位诱发：如：0.25％二已基亚硝胺 0.25～1 ml 灌胃×6月， 70％发生肝癌 • 异位诱发：将与致癌物作用过的器官或组织移 植于自体或同系、同基因正常动物皮下，诱发 所需的肿瘤。如：甲基胆蒽穿线法穿入幼鼠子 宫颈，将子宫颈切除，移植于同系成年小鼠皮 下，3个月后诱发异位子宫颈癌
体外培养的缺点
1.在体外细胞生物学行为与在体内不完全一样， G1 G0 S G2 终末分化
肿瘤细胞
M 介质细胞
2. 转化（ transformation ） : 在体外培养过 程中细胞的遗传性状发生变化。分为一般 转化和恶性转化。 一般转化：指细胞获得不死性。 恶性转化：指出现在软琼脂培养基中浸 润生长；在动物体内成瘤；血清依赖性降 低；生长密度依赖性降低。
肿瘤转移的基本过程
• 原发灶 血管生成/降解细胞外基质 癌细胞入血 / 淋巴管 癌细胞穿过管壁 细胞增殖/休眠 再次转移 • 机理：“种子与土壤”
侵袭模型
• 背侧品皮下移植侵袭模型 肌肉内移植侵 袭模型 腹腔内移植侵袭模型 • 肾包膜下移植侵袭模型 睾丸包膜下移植 侵袭模型 爪垫皮下移植侵袭模型 小鼠尾部移植侵袭模型 • 耳廓皮下移植侵袭模型 癌细胞侵袭视网 膜内界膜侵袭模型
• 直接研究 • 建立细胞系 • 建立动物模型
细胞系的基本概念
组织培养和细胞培养：模拟体内环境在体外培养机体 组织和细胞，使之生存和生长。 原代培养（primary culture）:从体内取出组织和细胞的 第一次培养。 传代（passage）：细胞长满培养瓶后，细胞分成2-3瓶继 续培养。 细胞系（cell line）:原代培养细胞首次传代成功后的细胞， 称 细 胞 系 。 Finite cell line, continuous cell line, established cell line 细胞株(cell strain):通过选择或克隆，从亲代细胞系选出 的带有特定标志的细胞群。 瘤株：在动物体内可传代的肿瘤细胞系。 ATCC American Type Culture Collection 美国模式培养物 收集中心, 美国菌种保存中心
实验肿瘤学基本概念
肿瘤发生发展的一般过程
正常细胞 癌细胞 原位癌 休 预防 诊断 治疗 浸润癌 眠 转移癌
肿瘤细胞的生物学特点
• • • • • • 自我满足的生长信号 对生长抑制信号不敏感 逃避凋亡 无限增殖的潜能 血管生成 浸润和转移
实验肿瘤模型的要求
忠实地重现人类肿瘤的生物学特性
实验肿瘤学的研究方法
鉴
定
细胞形态观察 癌细胞多角型，重叠生长， 核浆比例失调，多核巨细胞 染色体分析 数量和核型、核带，标记染色体 细胞生长曲线和细胞周期 集落形成率 动物接种 成瘤， 组织形态学与原发肿瘤相似 污染 无病毒、支原体污染、细胞间交叉污染 Hela cell: 1951年 Henrietta Lack 宫颈癌
按微生物控制分类
一级：普通动物，不携带人畜共患疾病病原体的动物。 二级：清洁动物，不携带人畜共患疾病病原体和动物传染 病病原体的动物。。 三 级 ： 无 特 定 病 原 体 的 动 物 （ specific pathogen free,SPF）, 动物体内不存在特定病原微生物和寄生虫的 实验动物。 四级：无菌动物，不存在微生物和寄生虫的实验动物。 一级动物只能用于教学和某些研究的预实验，卫生部以 上课题和研究生课题必须使用二级以上动物
免疫缺陷动物
裸小鼠（ nude mice）
1962年英国发现。鼠11号染色体裸基因nu是隐性突变基因。 裸基因纯合子（nu/nu）鼠的特征: 1. 全身无毛，裸体外表。 2. 胸腺上皮细胞不能增殖， T细胞发育受阻， T细胞免疫缺 陷。 3.B 细胞形态正常，功能较差，免疫球蛋白以 Ig M 为主，少 量Ig G ，类似于人原发细胞免疫缺陷。 随着鼠龄增加， T细胞增加，移植实验一般用4-8周鼠。 4. 裸小鼠抵抗力差，易患病毒性肝炎和肺炎，应饲养在SPF 环境。 5. 纯合型雌鼠不能生育，♀ /nu/+ 和♂ /nu/nu 交配可获 1/2 纯合子鼠。 常用BALB/c nu/nu, Swiss nu/nu, NC nu/nu 。
实验动物的分类(遗传背景)
• 近交系（纯系）：连续 20代以上兄妹交配或亲子交配 而获得的遗传上达到一致的动物群。如BLAB/c小鼠。 • 杂交群 : 两个近交系动物间有计划进行交配获得的第 一代动物。 • 封闭群：由同一血缘品系进行自由交配，在固定场所 保存繁殖5年以上得动物群，如Wistar 大鼠、SD大鼠。 • 突变系：正常染色体基因突变导致遗传缺陷的动物， 如裸鼠
动物肿瘤模型
• 自发肿瘤：动物自然发生的肿瘤，发病 过程与人类肿瘤相似，但发病时间早晚 不一，不易在短期内得到实验结果。
• 诱发肿瘤：用化学、物理、生物等因素 在动物体内诱发的肿瘤。物理、生物因 素诱发肿瘤的潜伏期长，发生率不稳定， 常用化学因子诱发肿瘤。常用于肿瘤病 因、化学预防的研究
诱发肿瘤模型的基本要求
3. 体外实验结果不能外推到体内实验
细胞培养的应用
• • • • 研究细胞与环境的相互作用 细胞间的相互作用 细胞内胞质活动 细胞质与细胞核之间的流动
建立细胞系的基本要求
• 细胞在体外培养半年以上，生长稳定， 保持细胞特征并能传代。
建系方法
1.原代培养：无菌操作， 取肿瘤组织，切成小片，小于 0.5 毫米，进行培养， 或用胰酶、胶原酶消化成单细胞悬液， 血清灭活酶，培养 2.传代：待细胞长满培养瓶，胰酶消化，按1：2-3传代 3.去除杂细胞 4.冻存细胞 10%DMFO+90%胎牛血清， 4℃ 30min, →-20℃ 2hrs, → -70℃ 过夜, →液氮，长期 保存。 登记，定期复苏细胞。 复苏：37℃ 水浴动物肿瘤模型
理论基础：1 肿瘤是癌基因突变/抑癌基因 失活的结果 2 基因功能在进化中是保守的
转基因动物
外源基因在动物染色体稳定整合并遗传给 后代的动物。 用途：生物医药 基因表达调控 单基因表达调控 多基因表达调控 基因敲除（knock out)
转基因方法
DNA
逆转录病毒/DNA转染
胚胎干细胞 显微注射
• 可移植性肿瘤 肿瘤组织在同种或异种 动物体内传代后获得的生物学特性学相 对稳定的肿瘤。
• 同种可移植性肿瘤 可分为实体瘤、腹水瘤、淋 巴瘤、白血病 到1997年我国65株。 腹水瘤：将可移植性实体瘤接种于同种动物腹 腔或腹壁，待肿瘤生长后形成腹水，再接接种 于同系肿瘤。用于药物筛选。 • 异种可移植性瘤： 免疫力正常动物：免疫隔离区 如眼前房、脑 内，或免疫抑制，如X线照射/可的松 免疫缺陷动物
应
用
• 建立人肿瘤的裸鼠移植瘤模型 • 研究致癌机理： 1〕在裸鼠体内诱发人类肿瘤：EBV 2〕生物因素的致瘤性：多瘤病毒只在新生 鼠或幼鼠诱发肿瘤，而在成年裸鼠也可 在远离注射部位诱发肿瘤，在雌鼠为乳 腺癌，雄鼠为骨肉瘤。
裸大鼠(nude rat)
1953年苏格兰在远交系hooded大鼠中发现， 因饲养不当而绝种。 1975年重新发现纯合子大鼠。纯合子 rnu/rnu 鼠无胸腺，缺乏功能性T细胞，抵 抗力低下。