除
• 插入外源基因长度受限删除非必须基因/必须基因 （由辅助病毒或宿主细胞提供该基因的功能）
◆反转录病毒(Retrovirus, RV)载体
优点：基因转移的效率 高，细胞宿主范围较广 泛，DNA整合效率高于 其它病毒载体等。 缺点：只感染分裂状态 的细胞，载体容量小（ ≤8kb），目的基因在 未分化的细胞中常丢失 ，随机整合潜在致癌的 危险。
通过从患者体内提取样本 (DNA)用基因检测方法来 判断患者是否有基因异常 或携带病原微生物的方法， 就是基因诊断。
生物技术与医药卫生
传统与基因诊断的比较
传统的诊断
–望 问 听 触——经验 –化验/检验——微生物、 免疫学、生物化学、病 理学等对细胞、组织、 酶、代谢物等检测
基因诊断
–应用分子生物学方法：如 PCR技术或PCR与分子杂交 标记 –主要应用于
基因治疗在未来人类重大疾 病的预防和治疗上必将发 挥越来越大的作用！
生物技术与医药卫生
七、基因诊断（Gene Diagnosis）
• G到T一个碱基的改变，决定了 一个人的命运
– 小皓珩出生23个月就出现皮疹、 便血等病状，患上了罕见的原发 性免疫缺陷病。 – DNA序列分析，证实了小皓珩WAS 蛋白基因的1388位核苷酸由G突 变为T，使编码谷氨酸的密码GAG 突变为终止密码TAG – WAS蛋白突变为无功能的WAS蛋白， 导致患儿血小板减少，淋巴细胞 形态和功能异常 – 希望：WAS目前已经可以用骨髓 移植或干细胞移植根治
2 ．种系细胞的基因治疗：在生殖细胞（精子、卵子 或未分化的受精卵）中引入正常基因或修复缺陷基因 以校正遗传缺陷。引入的外源基因（整合到基因组） 能遗传给后代。
优点：目的基因转移到机体的所有组织并遗传给后代。
目前尚未开展，一是涉及伦理学问题；二是技术困难 （诊断困难、引起新的插入突变的危险）
1.通过回体（ex vivo）基因转移的治疗途径
（一）基因治疗的病毒载体
• I. II. 应该具有的基本条件： 携带外源基因并能组装成病毒颗粒 介导外源基因的转移和表达
III.
对机体没有致病能力
病毒载体的产生
充分了解载体病毒的基因组结构和功能（编码区/非编
码区、结构蛋白/非结构蛋白、必须基因/非必须基因、
包装容量等） 外源基因插入病毒基因组的非必须区
I. 较大的基因组使得遗传操作较难进行
II. 不整合到宿主细胞基因组，表达持续的时间 受限 III.包含大量功能基因，安全水平尚待进一步观 察
◆痘病毒（Poxvirus, PV）载体
优点：
I. 安全，痘病毒在人类历史上已经广泛应用
II. 外源基因的容量可达30 kb III.适用广泛的细胞型（可感染非分裂的细胞） 缺点： I. 不整合入细胞基因组，故外源基因表达的时间不能持久
3. 多聚物/DNA复合物
• 阳离子多聚体 • DNA带负电 • 细胞表面带负电
4.其它方法
•受体介导基因转移技术 •磷酸钙共沉淀法 •电穿孔法 •显微注射法
五、基因治疗的应用
转入功能基因（单基因遗传病）
–血友病B 薛京伦等用逆转录病毒载体将IX因 子的cDNA至血友病B患者的皮肤成纤维细胞中， 再回植患者皮下，患者凝血因子IX的表达明 显增高，症状得到改善 –重症综合性免疫缺乏症（SCID）
II. 载体过大，受免疫系统的影响也较大。
（二）非病毒载体
1. 裸DNA 2. 脂质体/DNA复合物 3. 多聚物/DNA复合物 4. 其它方法
1. 裸DNA
• 方法：直接注射或基因枪轰击 • 溶液类型对基因表达有影响： 重组DNA可贮存于5%-30%的蔗糖溶液中 也可用生理盐水或PBS
2. 脂质体/DNA复合物
II.包装细胞系中包装好的复制缺陷型病毒颗粒
优点：简便省时省力，能很快观察到外源基因的表达及作用
缺点：DNA在体内不易进入细胞，易被降解，以病毒颗粒的形 式导入人体则易引起免疫反应和被补体灭活。
四、基因转移的方法
病毒载体 逆转录病毒载体 腺病毒载体 单纯疱疹病毒载体 非生物学方法 直接注射 脂质体 受体介导
Fig.3. PBS (A) or control virus Ad.GFP treated animals (B), or Ad.RGD.Pk7.GFP treated animals
Fig. 4. Significant inhibition of tumor growth and bloody ascites was shown in Ad.mda-7 treated animals (C) and Ad.RGD.pK7.mda-7 treated animals(E).
形成高效包装DNA的人造膜，与细胞膜极为相似。 形成脂质双层包围水溶液的脂质微球，与细胞融合后被 细胞内吞。
人工脂质体膜具有如下特点
1. 2. 3. 4. 5. 无毒性和免疫原性 可生物降解，不会在体内堆积 可制成球状(0.03-50 m)，包容大小不同的生物分子 可带有不同的电荷 具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适 应不同的生理要求
第八节 基因治疗与基因诊断
一、基因治疗的概念
◆基因治疗（gene therapy）——就是向有功能 缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿 其基因缺陷，从而达到治疗的目的。
Gene Therapy Principles
AAV
Nucleus
Adenovirus
Therapeutic Protein
◆腺病毒(AV)载体
优点： I. 安全，不整合到染色体上 II. 不需要宿主细胞的分裂增殖就能进入细胞 缺点：
I. 免疫原性较强
II. 不能整合到宿主细胞基因组使得外源基因 表达持续时间有限
III.插入外源DNA的能力也有限（≤7kb）。
◆疱疹病毒（HSV）载体
优点： I. 嗜神经组织 II. 能插入较长外源基因（20kb或略长些 缺点：


乙型肝炎病毒
丙型肝炎病毒 结核杆菌和疟原虫的分型
个体识别
• 公安司法系统——罪犯及受 害人的身份识别及亲子鉴定 • 部队—— 伤亡士兵的身份 识别；印尼海啸中死难人员 身份识别 • 保安—— 个人DNA身份证， 用于人员识别
14岁智障少女怀孕 亲子鉴定牵出70岁嫌犯
作业：
• “英国研究人员2007年4月12日宣布，他们在世界上首次 确认了一个与肥胖相关的等位基因，他们将之称为FTO。 这一研究成果发表在《科学》杂志上。”如果你是一名肥 胖症患者，你将如何根据这一新发现对自己进行治疗？请 简要写出治疗方案。 • “统计表明，全世界HBV（乙型肝炎）感染者和携带者达 3.5亿人之多。我国属HBV感染高流行区。2004年中国疾 病预防控制中心对中国居民营养与健康状况调查的血样进 行乙型肝炎病毒标志物的检测表明，我国现有的慢性HBV 感染者约1.2亿人，其中慢性乙型肝炎患者约3000万例。” 请你根据所学知识，谈谈用现代生物技术对乙型肝炎的诊 断及治疗方法。
重症综合性免疫缺乏症（SCID）
腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症是常染色体隐性遗传的 致死性疾病，患者由于ADA缺乏导致脱苷腺氨酸增多， 改变了甲基化能力，致使淋巴细胞受损，从而导致 免疫缺陷

1990年，首次将ADA转基因T淋巴细胞注射到 人体骨髓组织（患有－－腺苷脱氨酶（ADA） 缺乏症的4岁儿童） ，治疗SCID
Fig.2. Figure showing the enhanced tumor killing effect of genetically modified Ad.RGD.pK7. mda-7 and Ad.RGD.mda-7 viruses compared to unmodified Ad.mda-7.

基因治疗SCID的过程
生物技术与医药卫生
转基因治疗的问题与危险性
• 有效的目的基因过少； • 安全性:导入的基因缺乏调 控手段； • 有效性和稳定性：缺少高效 和导向的载体系统； • 目前人们多重视分子水平的 研究而忽略了整体研究，对 整体宏观水平缺乏了解。
1999年9月17日，美 国Arizona州18岁的 青年格尔辛格在宾夕 法尼亚大学人类基因 治疗研究所接受基因 治疗4天后不幸死亡， 成为基因治疗实施以 来第1个直接死于这 种试验的病人。
Target Cell
Retrovirus/Lentivirus
Naked DNA
二、基因治疗的策略
原位修复(基因修复）：对有缺陷的基因在原来 位置上进行修复，使该基因恢复正常 基因替代疗法：治疗策略是切除发生缺陷的基 因，再转入有功能的正常 基因增强：将目的基因导入靶细胞，目的基因 的表达产物可以补偿缺陷细胞的功能 基因抑制：导入外源基因以抑制原有的基因， 目的在于阻断有害基因的表达
又称间接体内基因转移，基本途径是： I. 个体供者组织或细胞移植物 组织培养 II. 治疗基因或标记基因培养细胞 III.选择或富集转基因细胞 IV. 转染细胞实验动物或受试病人的靶器官
2. 通过体内（in vivo）基因转移的途径
又称直接体内基因转移，将插入目的基因的表达载体直接导入 体内的方法。基本途径是： I.含治疗基因表达载体直接注射 /与介质结合后直接注射或用 基因枪导入体内
六、基因治疗关键问题
1.靶向性基因导入系统 基因治疗的关键问题是将治疗基因送入特定得靶细 胞，并在该细胞中得到高效表达； 2.外源基因表达的可控性 导入基因后无调控表达将会产生严重后果。最理想 的可控性是模拟人体内基因本身的调控形式； 3.治疗基因过少
Fig.1. Map of recombinant Ad.RGD.mda-7 and Ad.RGD.pK7.mda-7 adenovirus vectors genomes encoding mda-7.
• 先天遗传性疾患（苯丙酮尿 症、血红蛋白病） • 后天基因突变引起的疾病 （肿瘤、糖尿病） • 病原生物的侵入（流感、肝 炎、艾滋病） • 个体识别、法医物证