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的分子体积 ( V0 ) ,根据 Perrin 方程来计算荧光寿命[4] ,虽然这种方法所用仪器比较简单 ,但测定过
数有限 ,因此测量精度较差 。1980 年后多频相技术得到发展 ,相调制技术测定荧光寿命的精度也随之
提高 ,从而使复杂体系荧光寿命测定成为可能。但同时仪器也变得昂贵 ,实验测定难度也相应增大。
113 频闪技术[9]
频闪技术也叫脉冲取样 技 术 ( Pulse Sam2
pling Techniques) ,仪器工作原理示于图 3 ( a) 。
首先商品化 。此外 ,Edinburgh Instruments、IBH、HORIBA 等公司也在生产基于 TCSPC 的时间分辨荧
光光谱仪 。
TCSPC 的工作原理如图 1 所示 ,光源发出的脉冲光引起起始光电倍增管产生电信号 ,该信号通
过恒分信号甄别器 1 启动时辐转换器工作 ,时幅转换器产生一个随时间线性增长的电压信号 。另
除了直接应用之外 ,荧光寿命测定还是其它时间分辨荧光技术的基础 。例如基于荧光寿命测 定的荧光猝灭技术可以研究猝灭剂与荧光标记物或探针相互靠近的难易 ,从而对所研究体系中探 针或标记物所处微环境的性质作出判断 。基于荧光寿命测定的时间分辨荧光光谱可以用来研究激 发态发生的分子内或分子间作用以及作用发生的快慢 。另外 ,非辐射能量转移 、时间分辨荧光各向 异性等主要荧光技术都离不开荧光寿命测定 。因此本文拟对荧光寿命测定的主要方法 、各种方法 的原理 、特点以及荧光寿命测定的主要应用进行介绍 。
外 ,光源发出的脉冲光通过激发单色器到达样品池 ,样品产生的荧光信号再经过发射单色器到达终
止光电倍增管 ,由此产生的电信号经由恒分信号甄别器 2 到达时幅转换器并使其停止工作 。这时
时幅转换器根据累积电压输出一个数字信号并在多道分析仪 (Multichannel Analyzer) 的相应时间通
道计入一个信号 ,表明检测到寿命为该时间的一个光子 。几十万次重复以后 ,不同的时间通道累积
下来的光子数目不同 。以光子数对时间作图可得到如图 2 所示直方图 ,此图经过平滑处理得到荧
光衰减曲线 。
图 1 单光子计数( TCSPC) 测定
图 2 单光子计数荧光衰减曲线
荧光寿命工作原理图
形成示意图
实际测定中 ,必须调节样品的荧光强度 ,确保每次激发后最多只有一个荧光光子到达终止光电
倍增管 。假若一次激发引起的是多个荧光光子信号 ,则最先到达光电倍增管的 (寿命短的) 光子引
相调制技术也称之为“频域法”( Frequency2Domain Method) 。相调制与 TCSPC 不同之处在于样
品被正弦调制的激发光激发 ,发射光是激发光的受迫响应 ,因此发射光和激发光有着相同的圆频率 (ω) ,但是由于激发态的微小时间停滞 ———荧光寿命 ,调制发射波在相上滞后激发波一个相角 <。
上早在 1960 年就有人提出用频闪技术测定荧
光寿命[10] ,不过当时能够测定的荧光寿命在毫
秒级 、分辨率太差 ,实用价值不大 ,因此一直没
有得到广泛关注 。随着计算机技术的 发 展 ,
1987 年 PTI 公司将纳秒级频率荧光寿命测定仪
商品化[9] 。最近 PTI 公司推出了新一代频闪分
时光谱仪[11] ,据称新一代频闪分时光谱仪有着
另外 ,相对于激发波 ,发射波被部分解调 ,其振幅比激发波的振幅小 。利用实验测定的相角 < 和解
调参数 m (发射波振幅与激发波振幅之比) 可计算出相寿命 (τp ) 和调制寿命 (τm) ,对于单指数衰减 , τp 与τm 相等 。关于相调制法荧光寿命的测定原理可参见文献[ 4 ] 。
相调制技术所用仪器比 TCSPC 类仪器便宜 ,而且测定速度也快得多 ,但实验所能选择的频率
光被检测 。如果在预设时间内没有荧光信号到达终止光电倍增管 ,则时幅转换器自动回复到零 ,不
输出信号 。
TCSPC 法的突出优点在于灵敏度高 、测定结果准确 、系统误差小 ,是目前最流行的荧光寿命测
定方法 。但是这种方法所用仪器结构复杂 、价格昂贵 、而且测定速度慢 ,无法满足某些特殊体系荧
光寿命测定的要求 。
TCSPC 的准确性 ,比相调制测定速度更快 ,操作

也很方便 ,仪器价格也大大降低 。不过脉冲法 得到的荧光衰减曲线包含噪音的水平尚无法知
图 3 脉冲取样法测定荧光寿命工作原理图 (a) 工作原理图 ; (b) 检测时间门与
道 ,在数据分析时应当有所估计 。
荧光衰减关系示意图
除了上述三种主要的荧光寿命测定方法外 ,条纹相 机法 (Streak Cameras) [12] 和上转换法 (Upcon2
测定中 ,样品被脉冲光源激发 。与脉冲光源同
步 ,电压脉冲启动或按一定程式延迟启动光电
倍增管 ,光电倍增管按预设时间门 (Δt) 检测样
品的荧光强度 。一般检测时间门比荧光寿命短
得多 ,这样通过逐渐改变光电倍增管的延迟时
间 ,可以得到样品被脉冲光源激发后不同时刻
的一系列荧光强度 ,结果如图 3 ( b) 所示 。实际
1 荧光寿命测定
荧光寿命测定的现代方法主要有三种 ,即时间相关单光子记数法 ( Time2Correlated Single2Photon Counting , TCSPC) 、相调制法 ( Phase Modulation Methods) 和频闪技术 (Strobe Techniques) 。在这些方法 出现之前 ,人们也曾通过测定荧光物种在溶液中的荧光偏振 ( P) 、溶液粘度 (η) 以及估算荧光物种
version Methods) [13] 近年来也颇受人们关注 。
2 荧光寿命测定中的数据处理
211 荧光寿命及其含义
假定一个无限窄的脉冲光 (δ函数) 激发 n0 个荧光分子到其激发态 ,处于激发态的分子将通过
辐射或非辐射跃迁返回基态 。假定两种衰减跃迁速率分别为 Γ和 knr ,则激发态衰减速率可表示为
d n( t) dt
=-
(Γ + knr ) n ( t)
(2)
其中 n ( t) 表示时间 t 时激发态分子的数目 ,由此可得到激发态物种的单指数衰减方程 。
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荧光寿命测定的现代方法与应用
房 喻 王 辉
(陕西师范大学化学系 西安 710062)
摘 要 介绍了时间相关单光子计数 、相调制和频闪等三种现代荧光寿命测定方法的工作原理 ,指 出了各种方法的优点和局限性 ;介绍了时间相关单光子计数实验数据的处理方法 ;概述了时间分辨荧光 技术在化学和生命科学中的应用 。
程烦琐 ,而且不管荧光衰减机理 ,都只给出平均寿命 ,因此实际应用意义有限 。
1 P
-
1 3
≡
1 P0
-
1 3
1
+
R Tτ ηV0
(1)
111 时间相关单光子记数法[4 ,5]
TCSPC 是目前主要应用的荧光寿命测定技术 ,1975 年由 PTI( Photon Technology International) 公司
起时幅转换器停止 ,而长寿命的光子不被检测 ,这样实际得到的荧光衰减曲线将向短寿命一方偏
移 ,这种现象被称之为“堆积”效应 ( Pileup Effect) [6 ,7] 。为了避免堆积效应 ,实际测定时 ,多道分析仪
存储的光子数大致只有光源脉冲数的 1 %。也就是说 ,光源 100 次脉冲 ,大约只有 1 次所引发的荧
房 喻 男 ,44 岁 ,博士 ,教授 ,主要从事光物理应用和高分子胶体与界面研究 。E2mail :yfang @snnu. edu. cn 国家自然科学基金资助项目 (29973024) 和教育部中青年骨干教师基金资助项目 (3006) 2001201231 收稿 ,2001202225 修回
Key words Fluorescence lifetime , Time2correlated single photon counting , Phase modulation methods , Strobe techniques
荧光是分子吸收能量后其基态电子被激发到单线激发态后由第一单线激发态回到基态时所发 生的 ,而荧光寿命是指分子在单线激发态所平均停留的时间 。荧光物质的荧光寿命不仅与自身的 结构而且与其所处微环境的极性 、粘度等条件有关 ,因此通过荧光寿命测定可以直接了解所研究体 系发生的变化 。荧光现象多发生在纳秒级 ,这正好是分子运动所发生的时间尺度 ,因此利用荧光技 术可以“看”到许多复杂的分子间作用过程 ,例如超分子体系中分子间的簇集[1] 、固液界面上吸附态 高分子的构象重排[2] 、蛋白质高级结构的变化[3] 等 。
(4)
其中 I0 是时间为零时的荧光强度 。于是 ,荧光寿命定义为衰减总速率的倒数 :
τ = (Γ + knr ) - 1
(5)
也就是说荧光强度衰减到初始强度的 1Πe 时所需要的时间就是该荧光物种在测定条件下的荧光寿
命 。实际上用荧光强度的对数对时间作图 ,直线斜率即为荧光寿命倒数的负值 。荧光寿命也可以
理解为荧光物种在激发态的统计平均停留时间 。事实上当荧光物质被激发后有些激发态分子立即