动能→转动能级→分子的转动光谱;振动能→振动能级→分子的振动光谱;电子运动能→电子运动能级→分子的电子光谱.2由于平动能级只是在同一能级上运动,所以该能级不产生分子光谱.源.单色器.吸收池.光电检测器.显示器2主要技术指标:波长范围.波长精度.波长的重现性.光度的测量精度.光度测量的重现性.杂散光.分辨率.一步洗脱:实验室常用的洗脱方式,用一种浓度的洗脱剂进行洗脱,适用于组分比较单一或者被分离组分非常明确,吸附的量占主要部分2分布洗脱:采用不同浓度的洗脱剂或采用不同种类的洗脱剂进行洗脱,适用于两种以上的组分且吸附数量较少,分离度差别大的组分3梯度洗脱:采用浓度连续变化的洗脱剂进行洗脱,适用于多种组分且吸附数量较多,分离度差别较小,分离度差别较小,上述两种方法难以分离的组分 选择:缓冲容量: 在缓冲容量满足的前提下尽量降低缓冲液浓度;PH 值:缓冲液PH 值与等电点至少相差1个单位;离子强度:尽可能采用低离子强度;保护剂:某些特殊样品需加保护剂保持不稳定性质2选择原则有利于样品的稳定;有利于样品的吸附和洗脱;有利于样品的后处理;考虑缓冲液是否有毒性;考虑是否有热源 上样量:通常上样量不超过交换容量10%~20%2样液浓度:浓度不宜过高,若较高样液浓度,最好先用缓冲液进行稀释再上样3离子强度:样液离子强度不能过高,若高采用较高离子强度的缓冲液,若低采用低离子强度的缓冲液上样4流速:对浓度低的样液流速可快一些,对高浓度的样液流速可慢一些测器.显示器荧光~结构:激发光源.激发单射器.样品池.发射单色器.检测器.显示系统2差异:①测光角度不同,荧光分光光度计的检测器的位置与入射光源的方向成900角,其对面的背景为暗背景,紫外分光光度计检测器的位置与入射光源方向平行,其对面的背景为亮背景②单色器位置不同,荧光~设在检测器前面,样品的发射光经单色器分光后进入检测器,可以除去样品发射以外的辐射,使分析更有专一性,紫外~设在样品池前面,光束先进入分光器分光后再进入样品池③比色杯不同,荧光~使用的样品池是四面透光的样池可作为紫外用,紫外~两面透光的样池,不能作为荧光~用 缓冲液的选择:在被分析的蛋白质稳定的pH 范围内,凡是不与SDS 发生相互作用的缓冲液均可使用,但也要选择对蛋白质条带的分离和电泳速度有利的缓冲液.样品缓冲液要求低离子强度,均采用凝胶缓冲液的1/10,而SDS 含量应高于凝胶缓冲液 2.凝胶浓度的选择:不同相对分子质量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度3.样品的处理:a 还原SDS 处理:在样品溶液中加入SDS,还原剂β-ME,DTT 在100℃煮3~5min.b 带有烷基化作用的还原SDS 处理:碘乙酰胺的烷基化作用可以保护SH 基不易再氧化.c 非还原SDS 处理:在测定一些生化样品如体液.血液.尿液时,不希望破坏免疫球蛋白的四级结构,一般只用1%SDS 而不加还原剂在100℃煮3min,这种情况下二硫键未断裂,蛋白质没有完全去折叠,但不能用来测分子量的作用 SDS 是一种阴离子去污剂,它能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键,并结合到蛋白质分子上,使分子去折叠,破坏蛋白质分子内的二级和三级结构,使蛋白质变性而改变原有的空间构象2.解聚作用 β-巯基乙醇和二硫苏糖醇(DTT),作为一种强还原剂,它的作用是使蛋白质分子中半胱氨酸残基之间的二硫键打开并不易再氧化,在样品和凝胶中同时加入SDS 和还原剂DTT 后,由于还原剂作用,蛋白质分子被解聚成多肽链,形成单链分子3.蛋白质-SDS 复合物 解聚后多肽链的氨基酸侧链与SDS 充分结合,形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物.由于SDS 带有大量负电荷,大大超过了蛋白质分子原有的净电荷量,从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异.SDS 与蛋白质结合后,还引起了蛋白质构象的改变,蛋白质-SDS 复合物在水溶液中的形状近似雪茄烟的长椭圆棒,不同相对分子质量的复合物棒状物短轴长度一样,长轴长度与分子量大小成正比.这样复合物的迁移率不再受蛋白质原有电荷与形状影响,只与分子量有关.4.聚丙烯酰胺凝胶的分子筛效应 不同相对分子质量的亚基受阻程度不同,表现出不同的电泳速度,这样利用凝胶的分子筛效应就把同一样品中不同大小相对分子质量的蛋白质亚基分离开.:非选择性洗脱方法,应用于高度特异性吸附剂的结合,经一次洗脱将被吸附物质全部洗脱下来②分步洗脱:选择性洗脱方法,应用于基因特异性吸附剂,亲和吸附剂上吸附有特异性不尽相同的多组分样品,先用解吸附作用弱的洗脱液,再用解吸附作用强的洗脱液洗脱③梯度洗脱:选择性洗脱方法,利用洗脱液的浓度梯度变化,即解吸附能力逐渐增强,不同的被吸附物质被分别洗脱下来,比分步洗脱更有可能得到较纯的分离对象:在洗脱液中加入与亲和吸附剂上相同或不同的配基②离子强度洗脱:在强离子强度作用下,亲和层析的结合力减弱,将被吸附物洗脱下来③pH +离子强度洗脱:pH 变化再加上离子强度双重作用,适合洗脱结合得比较牢的物质④变性剂洗脱:加入变性剂有利于蛋白质的解离⑤化学断裂:采用专一的化学方法将配基将和载体之间的连接键裂解,避免发生不可逆失活:由激发单重态最低振动能级的跃迁产生的,磷光:由激发三重态最低振动能级的跃迁产生的.差别:二者都是在最低第一级电子激发态振动能级基础上以光子的形式释放能量的.谱线在通过原子化器时,被待测元素的基态原子所吸收,使原子灯发出被测元素特征谱线强弱发生改变,并引起原来辐射信号发生变化,通过检测特征谱线变化来测定原子特征吸收光谱,利用辐射信号变化的强弱来测定化合物中被测元素的含量对于已知被分离物质的等电点,若缓冲液的PH 值化被分离物质的等电点低,被分离物质带正电荷,选择阳离子交换介质,相反若Ph>Pi,被分离物质带负电荷,选择阴离子交换介质.2对于未知被分离物质的等电点,应做预实验,选择加入一种阴离子或阳离子交换介质等量加入若干试管,同时依次加入不同PH 缓冲液,再加入等量样品,混匀后检查每一试管上清液中待测样品被吸附后量的变化,若在某一试管中的样品恰好被吸附,该管就是在此离子交换介质下最佳的3吸附的差异,取两只试管分别加入等量的同一缓冲液,一支加入等量阴离子交换介质,另一支加入等量阳离子交换介质,在相同PH 条件下吸附被分离样品,然后测定两支试管吸附样品的量,做出判断电源不稳定,引起光源能量的波动或光电倍增管老化等原因,使仪器显示参数重现性差,造成测试数据不准确.②尤其是光源偶尔变化对测定结果影响较大.③当试样浓度过大或过稀时引起的误差更大.2如何减少误差:①当吸光值在0.15~1.00,尤其A=0.434,透光率控制在70%~10%,测量误差最小.②以最强的吸收带的最大吸收波长λmax 为入射光的波长,以得到最大测量灵敏度为准③狭缝的宽度与入射光的单色性成反比,狭缝宽度是测试时试样吸收峰半宽度的1/10为最佳.(狭缝的宽度增加,入射光的单色性下降,一定程度上使测试的灵敏度下降) 离子交换介质的影响 ①凝胶孔径对分离度的影响 大孔径的凝胶介质或实心球类介质对分离结果影响小 ②凝胶孔径对柱容量的影响 柱容量与介质的表面积成正比2离子交换柱长度的影响 离子交换柱的长短对分离影响不是很明显,一般选用短粗的层析柱,柱长容易造成分子筛效应,出现重叠现象,柱短有利于提高流速3缓冲溶液的影响①PH 影响:PH 值决定蛋白质带何种电荷,选择何种离子交换介质②缓冲容量的影响:缓冲容量的作用是保持溶液的PH 值稳定,若缓冲容量不能缓冲样品引起PH 值变化,溶液的PH 值发生漂移,导致解离度发生变化,从而影响溶液交换量③缓冲液浓度的影响:离子强度增加,离子与被分离物的亲和力增大,从而降低了被分离物质与离子交换介质的亲和力,会导致已结合上去的物质被洗脱下来④杂质的影响:样品中离子化合物受杂质反离子静电引力作用形成离子键,反离子与离子交换基团相互排斥,阻止样品与交换介质活性基团的活性作用4流速的影响:流速直接影响交换介质交换律,如果流速慢,溶液中的例子流过介质成需要的时间长,容易与介质发生交换作用,否则相反 1浓缩胶机理:在不连续系统中样品和浓缩胶缓冲液均使用pH6.8的Tris-HCl 系统,电极缓冲液使用Tris-Gly 系统,电泳开始后,在缓冲系统中HCl 全部解离成Cl -,在电场中迁移率快,为先导离子,甘氨酸解离度较小,仅0.1%到1%解离成Gly -,在电场中迁移很慢,为尾随离子,样品中蛋白质在此pH 下也带负电,一旦加上电压,这3种离子同时向正极方向移动,Cl-有效迁移率最大,走在前面,其后形成一个低电导区,Gly-由于解离度低,有效迁移率最小,蛋白质的有效迁移率介于2者之间,Cl-后面的低电导区有较高的点位梯度,使后面的蛋白质和尾随离子加速移动,当2种离子的迁移率与点位梯度的乘积相同时,他们的移动速度相同,在高电位梯度和低电位梯度之间形成一个稳定的并向阳极移动的界面,由于蛋白质分子介于Gly-和Cl-之间泳动,使蛋白质在移动界面上逐步堆积成一个狭窄的中间层,从而达到样品浓缩的目的.2分离胶作用机理:当cl-蛋白质-Gly-的移动界面到达浓缩胶,分离胶界面是,由于分离胶pH8.9比浓缩胶ph 明显增大,导致Gly 大量解离,此时Gly-的有效迁移速率随之增大并超过蛋白质的有效迁移速率,很快就越过蛋白质紧随Cl-之后移动,蛋白质受阻大,移动速度较慢被留在后面,不在受离子界面的影响,被堆积的样品组分从凝胶不连续的界面开始在固定的电位梯度下进行电泳迁移,蛋白质在分离胶中受到电荷效应和分子筛效应作用,各个组分被分级分离样液体积的影响:与吸附剂结合能力强的样品队体积要求不很严格,但吸附弱的物质样品浓度要高,上样量一般不超过柱床体积最大吸附量的5%2.流速的影响:样品上柱的流速应尽量地慢,保证被结合物与配基之间有足够的时间达到吸附平衡 3.柱长的影响:若亲和介质的吸附容量高,可选择较短的柱子;弱亲和性很低,选择相对较长的柱子,保证待分离物与亲和介质有充分接触时间,使二者较好结合 4.温度的影响:亲和介质的吸附强度随温度升高而减小(4℃吸附,23℃洗脱) 条件:①化学反应条件,显色反应生成的有色溶液,有利于与单色光形成互补色,并且在所测定波长有较大的光吸收峰;显色反应生成的有色溶液理化性质稳定,显色条件易控制,重复性.对照性好,反应物和生成物的最大吸收波长之差要在60nm 以上.②参比溶液的选择,a.试剂参比,当样液的组分比较简单与其他组分共存对所测定波长无任何吸收,可选用溶剂为参比;b.试样参比,显色剂与其他试剂在所测定的波长有吸收,可按显色反应得到的条件,选用不加试样的容易为参比或不加显色剂的溶液为参比;c.平行操作的溶液参比,用不含被测组分的试样,在同样条件下与被测试样同样处理后作参比溶液.2影响因素:①温度的影响,室温时影响不大,低温时邻近分子间的能量交换减少,而使光吸收强度比室温高10%有些化合物可增至50%以上②PH 值影响,许多化合物具有酸性或碱性可解离基团,在不同PH 溶液中,有不同的解离度,其吸光值也不同.③溶液浓度的影响,待测溶液的浓度过高.低,会使溶液中的某些分子发生变化,引起解离.聚合或沉淀等反应,从而影响测定的精度④仪器狭缝宽度影响,狭缝质量不好,或太大,所截获的单色光波长的单一性差,杂波就会与测定波长一起进入待测样品,干扰测定,引起误差.⑤背景吸收的影响,待测样品中存在着一些杂质有较大光吸收,造成背景吸收,使待测物质的吸光值增加,或引起待测物质的吸收光谱相重叠.电场强度的影响:电场强度高,带电颗粒泳动速度快2溶液ph 值的影响:ph 值距离蛋白质等电点越远,蛋白质带电线越强,泳动速度越快3溶液离子强度的影响:溶液离子强度越大,电动电势越小,泳动速度越慢4电渗的影响:带电颗粒的表观泳动速度是颗粒本身的泳动速度与电渗作用使溶液携带颗粒移动5温度的影响:温度升高时,介质黏度下降,迁移率增加6介质影响:介质的交联度影响分离,纯度影响聚焦,非特异性吸附增大电渗分离胶缓冲系统的选择:确保样品中各组分在此pH 带有同性电荷2浓缩胶缓冲体系的选择:pH 应比选定的尾随离子的pKa 低2到3个pH 单位3先导离子的选择:应考虑它有很高迁移率,与样品分子有同性电荷,对样品组分没有破坏作用4尾随离子的选择:一般应用pKa 比分离胶缓冲系统高1个pH 单位的弱酸或氨基酸5反向离子的选择:应选用pKa 比分离胶低一个pH 的弱碱,常用的是tris 离子,作用使维持溶液的电中性及pH.6电极缓冲液的选择:可选用与反向离子pKa 相同的ph 缓冲系统浓缩,样品进入分离胶前浓缩成一条窄条带,样品可浓缩300多倍.b 蛋白质在分离胶中的分子筛效应和样品的电荷效应,使样品获得较好的分辨率,尤其为梯度胶时.c 能够分离比较复杂和一些特殊的样品2,4个不连续性:a 凝胶浓度的不连续性.B 缓冲液离子成分的不连续性-凝胶(tris-Hcl)电极(tris-gly) c 缓冲液ph 的不连续性-浓缩胶(6.8),分离胶(8.9)电极(8.3)样品(6.8) d 电位梯度的不连续性3.3种物理效应:样品的浓缩效应;凝胶的分子筛效应;电荷效应 溶液中SDS 单体的浓度:为保证SDS 与蛋白质充分结合,SDS 总量至少要比蛋白质的量高3倍以上2.样品缓冲液的离子强度:只有在较低的离子强度溶液中,SDS 单体才具有较高平衡浓度,才有利于结合到蛋白质 3.二硫键是否完全被还原:只有二硫键被彻底还原的情况下,蛋白质分子才能完全解聚,SDS 才能定量结合到蛋白质分子上去,并使之具有相同的构象,亚基分子量才能定量测出辐射信号或引起信号的变化所采用的分析方法,发射和散射等作用建立起来的光分析方法,被色散开的单色光按波长大小而依次排列的图案,特征是不连续的明暗相间的线条所组成的光谱,特征是数个光带与暗区相间组成的宽带光谱,系统以光形式释放多余能量并产生相对应波长,离子或原子等在辐射能的照射下,在系统内吸收外界能量的过程中,所对应吸收的波长产生光谱化很小,且发射的光谱是连续的-可见光波区190-800nm 的分子吸收光谱的分析方法,是某些有机化合物和生物大分子吸收光能后产生价电子和分子轨道上电子在能级上跃迁而形成的吸收光谱 ,在一定浓度和波长等条件下物质的光吸收值,K表示mol/L,光程厚度为1cm 时的消化系数,单位L/(mol.cm)(OD)或吸光值(A),表示溶液吸收光的强弱或吸收程度,该介质有选择的吸收某一波长的光使入射光强度减弱,一束单色光通过吸收介质的溶液,吸收介质吸收部分光能,引起单束光强度降低,吸收介质的厚度和吸光物质的浓度与光降低成正比表示,T=I/I 0,I 0为入射光强度,I为透射光强度,T 越大,溶液浓度越低,在紫外可见光波区有特殊吸收峰吸收峰,但与发色基因同存在于同一分子,能引起生色基因吸收峰发生位移和光吸收强度增加子对的基团,如-OH,-NH2等能使该化合物的最大吸收峰的波长向长波长的方向移动些取代基以后,如=C=O,能使该化合物的最大吸收峰向短波长方向移动强度迅速下降 ,用一种波长的光照射在某一荧光物质时,该物质被激发,若能在极短时间内发射出较激发波长更长的波长的光,在激发态停留的时间大约10-8~10-4S,次现象叫荧光现象,发射的光谱是荧光光谱(10-4~10S),系统内发射出比荧光波长更长波长的光,称磷光现象,发射光谱称磷光光谱池浓度太大引起的荧光变弱现象态下对该原子共振辐射进行元素测定的分析法 率的光而产生的吸收线,产生正误差的干扰该颗粒沉降系数,单位s,1S=10—13s,离心管与离心轴平行，运行时，离心管与离心轴垂直。