土壤净氮矿化率的测定—厌氧培养法(Anaerobic method)一,实验目的1.掌握厌氧培养法测定土壤净氮矿化率的基本原理与操作方法2.掌握凯氏定氮的原理和蒸馏定氮器或氨气敏电极的使用方法返回二,实验内容1.土样的野外采集与处理2.土样水淹状态下厌氧矿化培养3.凯氏定氮法测定土样矿化率返回三,实验原理1.背景知识①土壤中的氮素氮素是蛋白质和核酸的重要组成部分,同时又是叶绿素,酶,维生素,生物碱等的必要成分,在植物细胞的生长,分化和各种代谢过程中,氮素都起着重要的作用.土壤中的氮绝大部分(约90%以上)以复合态存在于有机质或腐殖质中,而大多数的植物所吸收利用的氮素主要是无机态的铵态氮和硝态氮.土壤中的有机质和腐殖质等有机态氮通过氮素矿化作用(主要是土壤微生物作用)释放出无机态氮(主要是铵态氮与硝态氮),为植物吸收利用.返回②氮素矿化作用与土壤净氮矿化率氮素矿化作用是土壤中有机态氮经土壤微生物的分解,转化为无机态氮的过程,它在生态系统中是土壤对植物生长供给氮素的关键过程.土壤净氮矿化率则是描述土壤氮素矿化作用速率的指标,指单位时间内土壤有机态氮经矿化作用转化为易被植物利用的无机态氮的量.它在一定程度上反映了土壤对植物氮素的供应能力,对农业生产中作物的选择和肥料的施用都起着指导性的作用.③测试方法简介目前国内外土壤矿化氮的测定方法主要是生物培养法,此法测定的是土壤中氮的潜在供应能力,其结果与植物生长的相关性较高.生物培养法分为好氧培养法(aerobic method)和厌氧培养法(anaerobic method).好氧培养法:使土样在适宜的温度,水分,通气条件下进行培养,测定培养过程中释放出的无机态氮,即在培养之前和培养之后测定土壤中无机态氮(铵态氮和硝态氮等)的总量,二者之差即为矿化氮.好氧培养法沿用至今已有很多改进,主要反映在:用的土样质量(10～15g),加或不加填充物(如砂,蛭石)以及土样和填充物的比例,温度控制(25～35℃),水分和通气调节(如土10g,加水6mL或加水至土壤持水量的60%),培养时间(14～20天)等.很明显,培养的条件不同,测出的结果也会不同.厌氧培养法:通常以水淹创造条件进行培养(water logging method),测定土壤中有机态氮经矿化作用转化的无机态氮的量.其培养过程中条件的控制比较容易掌握,不需要考虑同期条件和严格的水分控制,可用较少土样和较短培养时间,方法简单且快速,结果的再现性较好,更适合于例行分析.故本试验采用厌氧培养法. 2,基本原理厌氧培养法基本原理用水淹保温法处理土壤,利用厌氧微生物在一定温度下矿化土壤有机态氮成为NH4+—N,再用2mol·L-1 KCl溶液浸提,浸出液中的NH4+—N,在碱液和还原剂的作用下用蒸馏法将NH3 蒸出,冷凝后用吸收液接收并滴定,从中减去土壤初始无机态氮(即原存在于土壤中的NH4+—N和NO3-—N),得到土壤矿化氮量.(也可以用氨气敏电极测定水溶性氨,取代滴定过程)四,实验仪器,试剂及配制1.主要仪器半微量定氮蒸馏装置;半微量滴定管(5ml)或PNH3-1-氨气敏电极四,实验仪器,试剂及配制2.试剂① 40%NaOH溶液称取工业用固体NaOH400g(用小烧杯做容器称取),取硬质1000ml玻璃烧杯,先加蒸馏水600mL,将称好的NaOH缓缓倒入并不断搅拌,以防止烧杯底角固结.冷却后倒入试剂瓶备用.(每样品用量5ml)四,实验仪器,试剂及配制②甲基红—溴甲酚绿混合指示剂0.5g溴甲酚绿和0.1g甲基红溶于100mL乙醇中.③ 20g·L-1 H2BO3—吸收液20g H2BO3(化学纯)溶于1L水中,每升H2BO3溶液中加入甲基红—溴甲酚绿混合指示剂5mL并用弱酸或弱碱(0.1mol/L的Hcl或NaOH)调节至紫红色.(指示剂灵敏范围紫黑色——紫红色,吸收液易受到酸碱污染,临用前配制并调色.)翠绿色暗绿色灰黑色紫黑色暗紫色紫红色酒红色碱————————————————————————————酸(每样品用量10ml)④0.02 mol·L-1 (1/2H2SO4)标准溶液(根据实际情况可选择合适浓度酸液)先配制0.10 mol·L-1 (1/2H2SO4)溶液,然后用标准碱液标定,再准确稀释而成.(精确)(每样品用量2-5ml)⑤ 2.5mol/L KCl称取KCl(化学纯)186.4g,溶于800ml蒸馏水中,定容至1L.(每培养样用量80ml) 四,实验仪器,试剂及配制⑥ 2.0mol/L KCL称取KCL(化学纯) 149g, 溶于800ml蒸馏水中,定容至1L.(每初始样用量100ml) 返回⑦ FeSO4—Zn粉还原剂将Fe SO4·7H2O(化学纯)和Zn粉共同磨细(或分别磨细,分别保存,可数年不变,用时按比例混合)以5 :1混合盛于棕色瓶中备用(混合后易氧化,保存不可超过一星期).(每样品用量1.2g)⑧ 比色液吸收液调色完成后,吸取吸收液10ml,置于50ml三角瓶中,用蒸馏水稀释置40ml. 五,实验方法与步骤1.土样的采集与处理土壤是一个不均一体,影响它的因素错综复杂,因此土壤样品的代表性与采样误差的控制直接相关,采样时要贯彻"随机"原则,即样品应当随机的取自所代表的总体.① 一般土样采取自2-10cm土层土壤,也可根据采集地主要作物根系深度采取土样.为样品的保存和工作的方便,从野外采回的土样都先进行风干.② 将采回的土样,放在塑料布上,摊成薄薄的一层,置于室内通风阴干.在土样半干时,须将大土块捏碎(尤其是黏性土壤),以免完全干后结成硬块,难以磨细.风干场所力求干燥通风,并要防止酸蒸气,氨气和灰尘的污染.③ 样品风干后,应拣去动植物残体如根,茎,叶,虫体等和石块,结核(石灰,铁,锰),再经研细,使之通过2mm孔径的筛子待测.五,实验方法与步骤2.培养土样准备称取过筛后的风干土样20.0g (记录质量)置于150mL三角瓶中,加蒸馏水20.0mL,摇匀(土样必须被水全部覆盖).加盖橡皮塞,置于40±2℃恒温生物培养箱中培养待测(七昼夜).3.土壤初始氮的测定① 称取过筛后的风干土样20.0g(记录质量),置于250mL三角瓶中,加2mol·L-1 KCl溶液100mL,加塞振荡30min,过滤于150mL三角瓶中.② 由进样口加入FeSO4—Zn粉还原剂1.2g,用吸管吸取滤液30mL由进样口加入(此过程尽量将还原剂冲入反应室),再加40%NaOH溶液5mL,立即封闭进样口并将预先将盛有20g·L-1硼酸—吸收液10mL的50ml三角瓶置于冷凝管下.③通蒸汽蒸馏,当吸收液达到40mL时停止蒸馏,取下三角瓶,用0.02mol·L-1 (1/2H2SO4) 标准液滴定并与比色液进行比色,当吸收液与比色液颜色基本一致后停止滴定,并记录滴定所用酸的量.同时做空白试验.(亦可采用氨气敏电极测定)注:如滴定用去的酸液少于1ml或超过5ml需调节酸浓度,使多数滴定值在2ml-4ml 之间.加碱液和加吸收液不能用同一个吸耳球,避免造成吸收液的污染.如果实验过程中发现原吸收液被污染,应停止实验,重新对原吸收液调色,并重新配置比色液.4.土壤矿化氮和初始氮之和的测定培养一周后取出矿化培养土样,加80mL 2.5mol·L-1 KCl溶液,再用橡皮塞塞紧,在振荡机上振荡30min,取下立即过滤于150mL三角瓶中.蒸馏滴定过程同土壤初始氮的测定.同时做空白试验.(亦可采用氨气敏电极测定)六,实验结果与计1.结果计算2.实验数据记录表3.拟结果记录表七,讨论对土壤矿化率可能产生影响的因素及产生影响的可能原因.(包括对人为误差产生的讨论)本实验除考虑测定样地土壤矿化率外,也可以分不同的小组从多个角度进行测定,并对各小组的实验结果进行比较,(如对不同土质土壤矿化率或同一土质不同深度的土壤矿化率进行对比实验)讨论结果并分析影响土壤矿化率的因素.八,思考题①如果矿化率为负值,讨论造成此实验结果的可能原因.②请根据本组或其他小组所完成的实验结果,分析影响土壤矿化率的因素和影响因素的作用机制.九,附录:半微量蒸馏定氮器使用方法(Makham型)此仪器有两种型号(见图1,2), 其结构极其相似,不同的是: 1型进样漏斗位置在蒸馏器上方,易于操作,装置合理,洗涤方便,但是保温能力稍差.2型进样漏斗在中部,保温层'7'几乎全部包围反应室,其优点保温好,蒸馏快.本仪器无蒸汽发生器,需自行配套.图1中的蒸汽发生装置可供参考,其制作如下:取2000ml或1000ml三角烧瓶, 装上胶塞和安全管, 通入绝缘导线,连接500W 电热丝,并外套瓷珠以绝缘,加入蒸馏水,通电加热,外接调压器可调节蒸汽大小.(也可用1000ml烧瓶和酒精灯自制简易蒸汽发生器)返回九,附录:半微量蒸馏定氮器使用方法(Makham型)操作方法先连接好冷却水(由' 4 '进水' 5 '出水) 并接通蒸汽发生器.先通蒸汽洗涤定氮器内室,待外室充满蒸汽后,关闭6.蒸数分钟,关闭进汽开关A.略等数秒钟,反应室2内废液即倒吸到7 (因蒸汽冷凝收缩形成负压所至),废液由6放出.返回九,附录:半微量蒸馏定氮器使用方法(Makham型) 返回样品测定把冷凝管下口插入接收瓶,催化剂和测试样品由进样漏斗加入,加NaOH5ml后迅速盖塞,加水液封.通入蒸汽,关闭6,从蒸馏出第一清蒸馏液(或指示剂变绿)开始计时,蒸馏约10-20分钟,将接收液离开冷凝管口,再蒸馏1分钟后停止,接收液马上进行滴定.蒸馏完毕后,由进样漏斗倒入蒸馏水洗涤反应室,同前反复洗涤倒吸3次,即可测下一个样品.九,附录:半微量蒸馏定氮器使用方法(Makham型) 返回注意事项(1)加样时,开关6须打开,以免倒吸.(2)吸收液应保持冷却,防氨挥发而损失.九,附录:半微量蒸馏定氮器使用方法(Makham型)附录 2 PNH3-1-氨气敏电极的基本原理与操作方法返回气敏电极是离子选择性电极的一个重要分支.它是指对样品中溶解的气态物质能直接响应的电极.因此氨气敏电极可直接响应水样中气态氨量,也可以在改变水样的pH等条件测定NH4-N总量.它是利用气体可渗透而离子不可渗透的膜,将样品溶液和内充溶液分开的一种电极.样品中溶解的气态物质,借助化学反应使其逸出,以扩散方式透过膜,从而引起膜内电解质中某一离子活度的变化,使得紧贴于膜内的离子选择性电位也变化,其电位变化值和样品溶液中气态物质的存在形态及其含量有关.附录 2 PNH3-1-氨气敏电极的基本原理与操作方法返回在溶液中, 当溶液的PH值大于14时溶液中的NH4+全部变成NH3 + H+附录 2 PNH3-1-氨气敏电极的基本原理与操作方法适用范围:水溶性氨浓度10-1 —— 5*10-6 mol/L 温度5-45 oC具体操作:1,蒸馏过程与半微量凯氏蒸馏滴定法基本相同,(直接使用20g·L-1 的H2BO310ml作为吸收液,而不用加指示剂),当吸收液达到40ml-50ml时将吸收液倒入100ml容量瓶中并加水定容,定容后倒入200ml烧杯中.2,将氨气敏电极插入烧杯中并开动搅拌器.3,加入40% NaOH溶液2-3ml,开动搅拌器3-5分钟后,读取电极电位值: E1. 4,从曲线上查得其浓度.5,根据稀释倍数可推算出样品中无机氮的含量。