第二章生物药物概论一、生物药物生产原料选择的主要原则、生物药物的特性及种类。

主要原则：有效成分含量高，原料新鲜；来源丰富，易得；原料产地较近；杂质含量少；原料成本低；易提取。

特性：（1）药理学特性：治疗的针对性强；药理学活性高；毒副作用小，营养价值高；生理副作用常有发生。

（2）生产、制备中的特殊性：原料中的有效物质含量低；稳定性差；易腐败；注射用药有特殊要求。

（3）检验上的特殊性：要有理化检验指标，和生物活性检验指标。

分类：按药物化学本质和化学特性分类：（1）氨基酸及基衍生物类（2）多肽和蛋白质类（3）酶和辅酶类（4）核酸及其降解物和衍生物类（5）糖类（6）脂类（7）细胞生长因子类（8）生物制品类（9）小动物制剂（10）动物器官或组织制剂。

按原料来源分类：（1）人体组织（2）动物组织（3）植物组织（4）微生物（5）海洋生物来源的药物。

按生理功能和用途分类：（1）治疗药物（2）预防药物（3）诊断药物（4）其他。

二、生物药物提取分离制备方法的工艺过程。

在对生物药物进行提取操作时，选择提取试剂需注意的问题。

工艺流程：1、生物药物原料的选择、预处理与保存（保存方法： 冷冻法，-40℃；②有机溶剂脱水法；③防腐剂保鲜，多用于液体）。

2、生物药物的提取：（1）生物组织与细胞破碎：磨切法，压力法，反复冻融法，超声波震荡破碎法，自溶法，酶溶法（2）选择合适的溶剂进行提取（考虑提取剂的用量、提取时间、提取次数，注意温度、变性剂等因素）。

3、生物药物的分离纯化：（1）蛋白质类药物的分离纯化：沉淀法，亲和层析法，疏水层析法（2）核酸类药物的分离纯化：提取法，发酵法（3）糖类：沉淀法，离子交换层析法（4）脂类：沉淀法，吸附层析法，离子交换层析法（5）氨基酸类：沉淀法，吸附法，离子交换法。

试剂的选择：1、对所需要提取的活性成分溶出度较高，对杂质较低。

2、不破坏活性成分。

3、利于后续预处理。

4、对环境影响较小，有利于回收和处理。

5、对设备要求不高。

6、成本较低。

7、最好对人体无害。

第三章基因工程制药一、基因工程制药的主要工艺过程。

获得目的基因→组建重组质粒→构建基因工程菌（或细胞）→培养工程菌→产物的分离纯化→质量控制→产品检验包装二、什么是目的基因？有几种获取方法？用于构建基因工程菌的目的基因应该达到什么要求？目的基因既是人们所需要的特定基因，一般也是接受目的基因的细胞或个体原本没有的基因。

获取方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库，从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段；（3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段（4）化学合成法；⑸逆转录（RT）-PCR法合成cDNA。

基本要求:不含多余干扰成分，纯度高；片段大小适合重组操作；结构、序列正确，达到一定数量。

三、基因工程克隆细胞和表达细胞、克隆载体和表达载体其各自特点。

克隆载体：1、具备复制原点，在宿主细胞内必须能够自主复制。

2、有一个或多个用于筛选的选择标记。

3、具备合适的限制性核酸内切酶的单一识别位点。

4、有较高的拷贝数。

表达载体：要使克隆基因在宿主细胞中表达，就要将他放入带有基因表达所需要的各种调控元件的载体中，这种载体就成为表达载体。

表达载体的结构比克隆载体复杂，除了必须具备与克隆载体相同的复制原点，多克隆位点和筛选标记基因以外，还必须有控制目的基因表达的调控序列，包括启动子，转录终止子等。

四、目的基因高效表达的方式有哪些？怎样全面提高目的基因的表达水平？有何措施？目的基因高效表达的方式：1.目的基因的不溶性高效表达。

表达的蛋白质往往形成不溶性的无生物活性的包涵体，需要经过溶解和复性才能获得有活性的目的蛋白。

2.目的基因的高效可溶性表达。

可溶性的目的蛋白本身常具有生物活性，无需复杂的变性复性的后分离过程，是一种很有希望的提高目的基因表达的新策略。

3.目的基因的高效分泌型表达。

目的基因的分泌型表达有两种情形：目的蛋白分泌到细胞周质中和目的蛋白转运到细胞周质后再分泌到细胞外。

对于能分泌到细胞外的表达系统，能进一步简化产物分离工艺。

提高目的基因表达水平的措施：1.对基因工程宿主菌进行改造。

如在上游阶段通过改造宿主的遗传性能从而减少或消除乙酸的生成；通过改造大肠杆菌使之能在贫氧条件下生长。

2.提高工程菌的质粒稳定性。

如在上游阶段质粒构建时插入抗生素抗性基因；在质粒构建时应该加入称为par和cer的位点（par位点能够在细胞分裂过程中使质粒分布更均匀，cer位点则能够防止多聚体质粒的形成，从而能从源头上提高质粒稳定性）。

在下游阶段采用细胞生长期和诱导表达时期分开的分段培养策略，另外还可采用培养条件循环控制策略和采用固定化细胞培养等。

3.选择能高密度表达的宿主菌和对重组菌进行高密度培养。

如选择培养时菌体密度和表达水平能尽可能高的宿主菌。

在下游阶段赋予工程菌生长和产物表达的最适环境条件。

4.减少乙酸等抑制性副产物的形成。

如在下游阶段设计好培养基的组成；选取合适的比生长速率；适当降低培养温度；限制性流加葡萄糖；将基因工程菌培养和乙酸的分离同时进行等。

5.选择能提高目的蛋白表达质量的宿主菌以及能提高目的蛋白表达质量的方法。

如在上游阶段选择尽可能地不产生或少产生能引起蛋白质变性或降解的酶系的宿主细胞。

而在下游阶段可采用将菌体生长与蛋白表达时期分开的策略。

（也可以分上、下游表述为：上游----对基因工程宿主菌进行改造；提高工程菌的质粒稳定性；选择能高密度表达的宿主菌；选择能提高目的蛋白表达质量的宿主菌。

下游----提高工程菌的质粒稳定性；对重组菌进行高密度培养；减少乙酸等抑制性副产物的形成；选择能提高目的蛋白表达质量的方法。

）五、工程菌的稳定性及其影响因素和考察方法。

基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性，这种不稳定性具有下列两种表现形式：1.结构不稳定性：重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰导致其表观生物学功能的丧失。

2.分配不稳定性：整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸。

影响基因工程菌稳定性的因素：遗传特性：1.载体的选择 2.宿主的选择 3.外源基因整合到宿主染色体上发酵工艺：1.培养基 2.生长速率 3.限制性机制 4.温度 5.pH和溶氧 6.外源基因表达六、基因工程菌的常见培养方式及其各自特点有哪些？连续式发酵对基因工程产品的大规模生产有什么优势？影响基因工程菌发酵的因素。

基因工程菌构建和基因工程菌生产其发酵研究各自的目的、意义及相应研究内容。

培养方式：分批培养，补料分批培养，连续培养，透析培养，固定化培养。

补料分批培养将种子接人发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。

连续培养将种子接人发酵反应器中，搅拌培养至一定菌体浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。

透析培养透析培养是利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。

固定化培养即将固定化技术应用于基因工程菌培养，基因工程菌经固定化后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别是对分泌型菌更为有利。

连续培养可为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，可为研究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等创造良好条件。

在连续式培养中，还可以将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开进行两阶段连续培养，并通过优化诱导水平、稀释率和细胞比生长速率这3个参数，可以保证在第一阶段培养时质粒稳定，在第二阶段可获得最高表达水平或最大产率。

影响基因工程菌发酵的主要因素：1、培养基的影响。

2、接种量的影响。

3、温度的影响。

4、溶解氧的影响。

5、诱导时机的影响。

6、诱导表达程序的影响。

7、pH的影响基因工程菌发酵研究内容：1、选择宿主菌：研究不同宿主菌对外源基因表达的影响2、基因工程菌的生长曲线测定3发酵条件对外源基因表达的影响4、重组质粒稳定性研究。

七、以包涵体表达形式的基因工程药物的分离纯化过程和方法，分离纯化出具有活性的蛋白质的一般步骤及其操作要点。

进行分离纯化研究涉及到的研究项目及内容。

过程方法及操作要点：1、菌体细胞的收集与破碎（既要使菌体破碎率尽可能高，又要保持包涵体的完整性）。

2、包涵体的分离、洗涤与溶解（通过离心法使包涵体与上清液中的碎片及杂质蛋白分开，包涵体洗涤的基本原则是杂质去除率尽可能高而不溶解包涵体中的目的蛋白。

溶解包涵体的试剂选择基本原则是对目的蛋白的溶解性强、选择性好；保护蛋白质的生物活性；安全性；适合后续各种操作；成本低）。

3、变性蛋白的纯化（对包涵体抽提物采用柱层析、凝胶过滤、离子交换层析和HPLC等方法进一步分离纯化）。

4、蛋白质的复性（恢复可溶性和生物活性，应考虑影响因素：蛋白质浓度、杂质含量、冲折叠速度、氧化还原剂用量和比例、重折叠配体的掺入、温度、pH、离子强度等）。

分离纯化研究：1、破菌研究：破菌方法及其条件研究，镜检评价其破碎效果，原则是使菌体破碎率尽可能高，又要保持包涵体的完整性2、包涵体的分离和洗涤研究：（1）分离包涵体时的离心力和时间的考察；（2）洗涤剂及其他浓度、用量研究；（3）洗涤时间和温度研究。

包涵体洗涤操作的基本原则：（1）洗涤剂杂质去除率尽可能高，而不溶解包涵体中的目的蛋白；（2）分离包涵体时的离心力和离心时间尽可能满足将包涵体与细胞碎片等杂质很好地分离。

3、目的蛋白的变性（抽提）研究：（1）变性剂及其浓度、用量的研究（2）变性操作时间和温度研究（3）变性操作后的固液分离（离心力和离心时间）研究。

4、变性蛋白的纯化研究：对包涵体抽提物可采取柱层析、凝胶过滤、离子交换层析和HPLC等方法进一步分离纯化。

Ps：重组蛋白的纯化可以在包涵体溶解后进行，也可以在复性后进行，因此还应进行两种方法的对比研究。

5、变性蛋白的复性研究：考察比较不同复性方法对目的蛋白复性效果的影响。

主要考察其对蛋白回收率和复性程度的影响；另外，还需要考察复性时间的影响因素，如蛋白质浓度、杂质的含量、重折叠速度、氧化还原剂的用量和比例、重折叠配体的掺入、温度、pH值和离子强度等对复性效果的影响。

6、目的蛋白的高度纯化研究：对经复性后得到的目的蛋白进行进一步高度纯化，以满足不同的需要。

八、基因工程药物质量控制的必要性及其质控要点，基因工程药物最终产品的质量控制特点及要点。

必要性：1、它是利用获得细胞作为表达系统来制备产品，所获得的蛋白质往往分子量较大，并且具复杂的表达结构；2、许多基因工程药物都是参与人体一些生理功能精密的蛋白质，在极微量的差别的情况下产生显著效应；3、宿主细胞中表达的外源基因在翻译、转录及工艺放大的过程中会产生变化。