K s Si
限制性底物浓度对 比生长速率（µ ）的影响
Si Ks
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溶解氧作为底物
• 氧是细胞生长和代谢所必需底物之一 • 氧在水溶液中的溶解度极低 • 为了满足细胞的生理 要求，反应器操作 （主要是搅拌转速和 通气流量）必须及时 向培养体系提供氧气， 避免耗尽
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扩散
• 菲克第一定律（Fick’s first law）
– 在单位时间内，通过垂直于扩散方向的单位截面积的 扩散物质流量与该截面处的浓度梯度成正比，即浓度 梯度越大，扩散通量越大 – 扩散物质流量：单位时间内，分子 L 通过单位面积 的净数量 分子 L 沿扩 dC L 散方向的 Flux D dx 浓度梯度 分子 L 的 有效扩散系数
（Doran：Bioprocessing Engineering Principles）
意义：边界层的存在，不仅影响流体流动的性质，而且会 影响各相之间传热和传质。
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对流：粘度概念
• 内部同心圆柱体的转动能否带动外圆筒的转动？ • 液体的性质：拉拽作用力的传导介质 • 液体介质的作用面积直接影响作用力大小 • Brookfield 粘度计工作原理
圆形横截面管道 搅拌式发酵罐搅拌桨
D υ ρ μ
管径 平均线性流速 流体密度 流体粘度
Ni Di ρ μ
搅拌桨转速 搅拌桨管径 流体密度 流体粘度
层流：小于 2,100 过渡：2,100 - 4,000 湍流：4,000
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搅拌桨形状对液体流动状态影响 很大，层流状态一般低于 10
计算（以1000 毫升计算）： 1. 1000 毫升培养液中 DO 的总量为 (1.0 mM x 21% - 0) = 0.21 (mmoles) = 0.21 x 10-3 2. 1000 毫升培养液中总活细胞数量为 5 x 106 (cells/mL) x 1000 (mL) = 5 x 109 (cells) 3. 活细胞每小时的需氧量（假设不随 DO 降低而变化） 5 x 109 (cells) x 3.2 x 10-13 (moles/cell/hour) = 1.6 x 10-3 (moles/hour) 4. 耗尽 DO 所需时间为 0.21 x 10-3 (mles) /1.6 x 10-3 (moles/hour) = 0.13 (hour)
细胞袋预先消毒，一次性使用，不必清洗 通过支架的摇摆实现主体混合 DO/CO2/pH 控制 0.1 - 500L
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特殊细胞营养物质 - 溶解氧（DO）
• 细胞生理代谢需要量最大的必需营养物质： 1 C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O • 氧气以溶解氧（DO）形式在水溶液中存在，常温下溶解度非常低 • 一个大气压 • 空气（其中 O2 占 21%） • 37oC 培养基溶液（盐类溶质的存在降低其溶解度） • 饱和浓度约为 0.21 mM • 相较于葡萄糖浓度（如 25 mM），溶解氧不足以满足细胞生长需要， 需要不断提供通氧（向反应器内部鼓气，或培养基顶部界面换气） (25 - 0) x 6 / (0.21 - 0) = 714.3 (倍) • 细胞膜对氧分子具有通透性，氧分子通过被动扩散进入细胞内部
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扩散
• 在流体（气体或液体）内部，分子间每秒钟发生数 以万亿次碰撞，每次碰撞都会导致溶质和溶剂分子 的运动方向改变； • 分子的扩散速度取决于其大小、形状、温度和流体 粘度（流动阻力）； • 宏观效果：分子从浓度较高区域迁移至较低区域； • 可类比物理现象 – 热量（温度） – 流体流动（压力）
• 定义
– 沿着流路，并显示流速与相对位置关系的表示方法； – 线条的疏密程度表示流速的相对大小。
恒定流速 低流速中有障碍物 发酵罐挡板区域
湍流 层流
漩涡
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（Doran：Bioprocessing Engineering Principles）
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对流：雷诺准数（Re）
• 流体的流动状态，取决于流体的流速、粘度、密度、以及 流路的几何形状； • 雷诺准数是用来描述流体的流动特点的参数（无物理单位）
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对流（流动）
• 由于重力、压力或剪切力的存在，流体（气体或液 体）主体发生流动，溶于其中的溶质随之移动； • 溶质的扩散现象同时存在 – 如果流体流动相对比较慢，溶质的扩散现象对 其传递起主导作用； – 如果流体流动相对比较快，液体主体流动对溶 质的传递起主导作用； • 粘度：流体对流动的摩擦阻力，受温度和压力影响 • 密度：显示物质内部分子之间的紧密程度
O2 (mM) 2.18
1.70 1.54 1.38 1.26 1.16 1.09 1.03
1.0
2.0
1.16
1.12
1.12
1.02
0.89
0.71
来源： Bailey & Ollis (1986), Biochemical Engineering Fundamentals (2nd ed.), p 463
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扩散：室温下物质的扩散系数范围
物质与扩散媒介 Gases in gases Gases in liquids Small molecules in liquids Proteins in liquids Proteins in tissues Lipids in lipid membranes Proteins in lipid membranes 扩散系数 (cm2s-1) 0.1 to 0.5 1 x 10-7 to 7 x 10-5 1 x 10-5 1 x 10-7 to 7 x 10-7 1 x 10-10 to 7 x 10-7 1 x 10-9 1 x 10-12 to 7 x 10-10
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在不通氧的条件下，DO 耗竭需要多久？
假设条件： 1. 活细胞密度为 5 x 106 (cells/mL) 2. 细胞比需氧量为 3.2 x 10-13 (moles/cell/hour) 3. 培养基为 100% 空气饱和（一般为 50% 左右），纯氧饱和溶解度为 1.0 mM。
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对流：边界层概念
定义
• 当流体与静止物体相接触时，受 到影响的流体薄层被称作边界层； • 在静止物体表面，流速为零，称 作静止层； • 由于流体粘度作用，边界层内部 与静止层相邻的液层流速会降低 （粘滞阻力）；离静止层越远，粘 滞阻力越弱，流速越高，逐渐接近 主体流速。因此，在边界层内部存 在一个速度梯度。
动物细胞培养 生物反应器
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1 1
4. 分子传递现象
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2
分子传递的基本物理现象
扩散（Diffusion） • 由于分子碰撞而 传递热能所引起 的分子随机运动 • 举例：气泡外周 液体滞流层内溶 解氧分子的扩散 对流（Convection） • 由于流体主体的运 动所引起的传递 • 举例：滞流层被从 气泡外周置换离开 气泡之后，溶解氧 分子随液体流动而 位移至反应器的其 它位置
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搅拌式生物反应器 – 通氧方式
（1）底部通氧（主要） • 通氧效率高 • 产生气泡，需要采取保护措施 （2）顶部通氧（辅助） • 通氧效率较低，适合细胞浓度低的接种初期阶段 • 不产生气泡
（2）
（1）
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WAVE Bioreactor - Cellbags
• • • •
粘度
F A
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dv dy
dv dy
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流 体 的 流 变 学 分 类
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对流：粘度的意义
• 粘度是影响流体行为最重要的流体性质，相当于流 体本身对流动所施加的摩擦阻力，损耗机械能 • 粘度对流体的泵送、搅拌混合、传质、传热和液体 通气，都有显著作用，因此，对于生物过程设计以 及经济成本也有重要影响 • 培养液的粘度受细胞、底物和空气影响。
流体 薄层
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对流：粘度（µ ）
1. 将液体注入上下两块平板之间， 距离 D，面积为 A 2. 当下板发生移动时，流体随其 运动，但上板表面液体速度为 零，因此形成速度梯度 3. 剪切力 F 与速度梯度成正比
dv F dy
4. 剪切应力定义
Doran：Bioprocessing Engineering Principles
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氧的溶解度
一个大气压下，温 度对纯氧在水中溶 解度的影响
温度 (oC) 0
10 15 20 25 30 35 40
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一个大气压下（25oC）, 纯氧在 不同浓度电解质溶液中的溶解度
电解质 （M) 0.0 0.5 O2 (mM) HCl 1.26 1.21 H2SO4 1.26 1.21 NaCl 1.26 1.07
搅拌桨作用 扩散作用
较小 漩涡
最小 漩涡
0.25
较大 漩涡
cell
æn 3 ö Kolmogorov scale（cm） h = ç ÷ èe ø
n e
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培养基运动粘性系数 (cm2/s) 单位质量流体能量耗散速率 (cm2/s3)
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搅拌式生物反应器 – 混合效果评估
• 方法：在固定位点跟踪标示物浓度
粘度（常温） 密度 Gases 10－4 0.001 运动粘度 0.1
Water Glycerol