淋巴细胞贴壁培养法得到单核细胞
（采血管在超净台中开启，按细胞培养操作）
①抽取患者肝素抗凝外周血8ml，颠倒1-2次混匀
②在1 小时内（20℃，RT）进行处理，2500 rpm (820 g)，离心10分钟
③无菌条件下，用吸管弃上清。

④小心吸取中间层白细胞转入2只无菌15ml管中，管中预先加入2-3ml PBS
（RT），终体积4ml，轻柔吹打混匀。

⑤另2个无菌15ml管中加入4ml淋巴细胞提取液（RT），将5中液体沿壁轻柔
加在提取液上，动作轻，避免细胞进入淋巴液中。

⑥400g离心30分钟，RT，得到单个核细胞层
⑦将上清小心吸出，取中间云雾状细胞置于无菌15ml管中，加PBS 10ml，轻
柔颠倒混匀，1000-1500rpm，10min，可见底部有白色细胞团，弃上清。

⑧将细胞用PBS重悬，2管合并为1管，终体积10ml；1000rpm，10min，洗涤
一次。

弃上清。

⑨细胞重悬于RPMI1640，37℃、5%CO2培养箱细胞培养板进行2-3小时附壁
纯化。

⑩小心吸取上清，去掉未贴壁细胞。

贴壁细胞为单核细胞。

加入RPMI1640 37℃、5%CO2培养。

备注：
1、操作要轻柔，避免产生很多碎片，第6步的离心时间20min 也可以达到实验目的。

2、最好在刚开始的时候不要将每个人的血混合在一起提取，避免发生溶血现象，当提取到淋巴细胞的时候，可能将人的混合在一起，按照我拉计数的经验，每毫升全血中提取到的单核细胞，刚好可以种在一个12孔板里（1ml）,也可以种在24孔板（600ml），为发更好的贴壁，建议可以购买包被好的培养板（公司有包被好的，也可以自己包被）。

一般贴壁2小时就可以了，如果不放心的话，可以贴2.5小时，甚至3个小时，此时，更换含血清的培养基（1640+[6-10]%FBS+1%双抗+100ng/mlM-CSF）进行培养7天，每48小时更换一次培养基（含1640+[6-10]%FBS+1%双抗+100ng/mlM-CSF），7天后，用LPS+INFγ刺激细胞为
M1型巨噬细胞，用IL-4刺激细胞为M2巨噬细胞。

PS：据说（文献中看到过）有直接用来刺激细胞成长为M/M21型巨噬细胞的培养基，但是我没有找到，希望做相关研究的小伙伴可以找找看哦！
PS: 个人经验，人原代单核细胞很难做转染实验，因为所需要的细胞太多了，需要很多血，有个国外朋友也在做人单核细胞相关实验，他们是直接和血库联系，因为现在输血一般都不会再输全血了，只需要红细胞，血小板等，白细胞一般都很扔掉的，所以如果有认识血库的小伙伴们，可以通过这一途径实现你的实验哦，听他说每次得500ml,但是具体的血量，还得根据你的实验目的和实验设计来看哦！
希望能给你带来一点点的帮助，加油！！！。