小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数实验背景：一、细胞培养的基本条件：1.无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素2.细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清3.细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器4.细胞保存条件：液氮罐1.超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。

净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。

2.Zeiss滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。

3.CO2培养箱：CO2培养箱设定的条件为37 ℃，5％CO2 。

使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。

②保持培养箱内空气干净。

定期消毒（90 ℃，14 h)。

③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。

三、细胞培养用液的配制：1.水：新鲜配置的三蒸水或去离子水2.平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl 8.0 gKCl 0.2 gNa2HPO4.H2O 1.56 gKH2PO4 0.20加水至1000 ml3.消化液：①胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。

②胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。

③胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。

用滤器过滤除菌。

④胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。

⑤用含血清培养液终止其对细胞的消化作用4.培养基：培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。

①天然培养基：天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。

优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限，成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。

易发生支原体污染。

②合成培养基：合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。

目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。

合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。

优点：标准化生产，组分和含量相对固定。

成本低。

缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。

③人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。

血清中含有：A多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）；B多种金属离子；C激素；D促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；E各种生长因子；F转移蛋白；G不明成分。

④一般说来，含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死，但支持细胞生长一般需加10％血清．对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚．血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。

在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞．无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子等。

无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。

1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。

无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。

向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。

适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。

即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。

无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。

目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清。

血清质量好坏是实验成败的关键。

常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。

优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。

血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃，30 分钟血清的消毒：过滤除菌⑤抗菌素的使用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。

通常是青霉素和链霉素联合使用。

培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。

庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定。

⑥完全培养基的组成：基础培养基80％一95％血清5％一20％碳酸氢钠 2.0 g/L青、链霉素各100单位／毫升培养基的配制：RPMI-1640培养粉1袋碳酸氢钠 2.0 g青、链霉素各100单位／毫升加三蒸水至1000ml, 过滤除菌；调节pH值至7.2；加血清（终浓度10％）。

主要培养基:MEM：低限量Eagle培养基DMEM：Dulbecco’s Modified Eagle Medium，贴壁细胞IMDM：Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium，密度低、生长困难细胞，杂交瘤细胞RPMI1640：Moor等研制成功，悬浮、肿瘤、原代、传代等细胞199、109培养基：Morgan研制成功Mccoy’s 5A：原代培养、难以培养的细胞四、培养用品的清洗和消毒灭菌：1.清洗:①玻璃器皿：一般用毛刷和洗涤剂进行清洗，以去除器皿的杂质。

要注意两点：一是洗刷时不宜用力过猛，二是不能留有死角，特别要注意瓶角度等部位的洗涤。

洗刷后用蒸馏水冲洗三次，去离子水冲洗一次。

晾干②胶塞盖子等杂物:细胞培养中所用的橡胶制品主要是瓶塞。

新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理，常规清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH或洗衣粉煮沸10-20分钟，以除掉培养中的蛋白质。

自来水冲洗后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟，晾干备用。

③塑料制品的清洗:塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品。

必要时用2% NaOH浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。

2.泡酸泡碱①玻璃器皿:玻璃器皿一般用由浓硫酸，重铬酸钾及蒸馏水配制而成的清洁液浸泡。

清洁液配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。

配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。

并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。

并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。

配成后清洁液一般为棕红色。

泡酸时应将器皿轻轻放入，避免灼伤；还应是器皿内全部充满清洁液不留气泡；一般浸泡过夜。

②胶塞盖子等:清洗后将用品放入1mo/LNaOH中浸泡6-7h。

3.物理消毒灭菌法：①热力消毒灭菌法：利用热力作用破坏微生物的蛋白质、核酸、细胞壁、细胞膜，导致其死亡，可分为干热法和湿热法。

A燃烧法：属于干热法，是一种简单、迅速、彻底的灭菌方法。

用途：a无保留价值的污染物品。

b金属器械及搪瓷类物品急用，或无条件消毒时，锐利刀剪除外，以免锋刃变钝。

方法：a金属器械可在火焰上烧20秒。

b搪瓷类容器可倒入少量95%乙醇。

B干烤法：利用特制的烤箱，热力通过空气对流和介质传导进行灭菌，效果可靠。

C煮沸消毒法：属于湿热法，用于耐湿、耐高温的搪瓷、金属、玻璃，橡胶类物品，不能用于外科手术器械的灭菌。

从水煮开始计时，5-10分钟可杀灭繁殖体，15分钟可将多数细菌芽胞杀灭，如破伤风杆菌芽胞需煮60分钟才可杀灭，在水中加入碳酸氢钠，配成浓度为1%-2%的溶液时，沸点可达105度，即可增强杀菌作用，又可去除防锈。

注意：a物品需全部侵入在水中，物品盖子打开，轴节打开，空腔导管预先灌水，各种大小及形状相同的容器不能重叠。

b玻璃类物品需用纱布包裹，并在冷水或温水中放入。

c橡胶类物品需用纱布包好，水沸后放入。

d如中途加入其它物品，需等再次水沸后开始计时。

e高原地区气压低，沸点低，需适当延长煮沸时间，一般海拔每增高300m，煮沸时间延长2分钟。

D压力蒸汽灭菌法：属于湿热法，是一种临床上应用最广泛，效果最为可靠的首选灭菌方法②光照消毒法（又称辐射消毒）主要是通过紫外线的杀菌作用，使菌体蛋白发生光解、变性，导致细菌死亡。

A日光暴晒法：利用日光的热、干燥、紫外线的作用来杀菌，将床垫、毛毯、书籍、衣服等放在阳光下直射，暴晒6小时可达到消毒效果，中间要定时翻动。

B紫外线灯管消毒法：紫外线属于电磁波辐射，常用于空气、物品表面的消毒，杀菌最强的波长范围250-270nm从灯亮5-7分钟开始计时。

注意：a空气消毒：有效距离不超过2m，照射时间20-30分钟。

b物品消毒：有效距离不超过25-60cm，照射时间20-30分钟。

③注意事项：A保持室内清洁、干燥，室内温度20-40度，相对湿度40%-60%时，紫外线消毒最为宜。

B保持紫外线灯管清洁，一般每2周用无水乙醇擦拭1次，发现有污洉应随时擦拭。

C保护眼睛和皮肤：紫外线对眼睛和皮肤有刺激作用，易引起眼炎、皮炎且臭氧对人体不利，因此一般不在有人的环境中使用，必须使用时应带防护镜，穿防护衣，或用被单遮盖肢体。

D紫外线穿透力较差，消毒时物品应摊开或挂起，且定时翻动及保证各表面均受到直接照射，如需再次开启，应间隔3-4分钟。

E定期检测紫外线灯管照射强度，一般每隔3-6个月1次，或建立登记卡，使用时间超过1000小时应予以更换。

F定期做空气培养检测消毒效果。

④臭氧灭菌消毒法：利用臭氧强大的氧化作用进行杀菌。

A用途：主要用于空气、医院污水、诊疗用水、物品表面的消毒。

B方法:使用时应关闭门窗，人员离开房间，消毒结束后30分钟方可进入。

⑤电离辐射灭菌法(又称冷灭菌)适用于不耐热的物品消毒，如橡胶、塑料、高分子聚合物(一次性注射器、输液输血器等)、紧密医疗仪器、生物医学制品、节育用具及金属等。

⑥微波消毒灭菌法微波可杀灭细菌繁殖体、真菌、病毒、细菌芽胞、真菌孢子等各种微生物。

常用于食品、餐具的处理，化验单据、票证的消毒，医疗药品、耐热非金属材料及器械的消毒灭菌。

不能用于金属物品的消毒。

4.化学消毒灭菌法：化学消毒灭菌法是利用液体或气体的化学药物渗透到菌体内，使菌体蛋白凝固变性，细菌酶失去活性，导致微生物代谢障碍而死亡，或破坏细胞膜结构，改变其通透性，导致细胞膜破裂、溶解，以达到消毒灭菌的目的。

①化学消毒剂的使用原则A待消毒的物品的物品须先洗净、擦干B根据不同物品的性能及各种微生物的特性，选择恰当的消毒剂。