2013-2014年度第二学期基因工程期末考试
卷型：A 考试时间：90分钟满分：100分
一、名词解释（3×5）
限制性内切酶(或其它工具酶)：能在特异位点上催化双联DNA分子断裂，产生相应的限制性DNA片段
荧光定量PCR:所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法
（半定量PCR:是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量）
星活性：非标准条件下切割相似序列，产生非特异性片段
同裂酶（或同尾酶）：来源不同但具有相同识别序列，产生相同或不同末端
转基因技术（或转基因动植物等）：就是将人工分离和修饰过的基因导入到目的生物体的基因组中，从而达到改造生物的目的。
二、填空（1×15）
1.Cosmid 实际上是由cos 位点和质粒构成的杂合载体，也可以说是带有cos 序列的质粒。
2.超螺旋质粒DNA、开环质粒DNA、线状质粒DNA 在琼脂糖凝胶电泳的特点是：电泳的泳动速度由大到小分别是：超螺旋质粒>线状质粒>开环质粒。
3.质粒DNA的提取方法有碱裂解法、煮沸法、去污法。
4.基因工程中常用载体是质粒、噬菌体、动植物病毒。
5.设计引物是一般要求C+G的比例在40%-60%，长度在17-30bp 。
6.BAC载体与常规载体的区别在于复制单元的特殊性。
三、选择题（2×15，实卷应是1×35）
1.基因工程创始人（D）
A A. Kornberg
B W. Gilbert
C P. Berg
D S. Cohen
2.迄今为止所发现的限制性内切核酸酶可以作用于（C）
A. 既可以作用于双链DNA ，又可以作用于单链DNA
B.只能作用于单链DNA
C. 只能作用于双链DNA
D.只能作用于RNA
3.氨苄青霉素的工作原理为（A ）
A.可以抑制细胞壁肽聚糖的合成
B.可以抑制核糖体的转位
C.可以与核糖体50S 亚基结合并抑制蛋白质合成
D.可以与核糖体30S 亚基结合并抑制蛋白质合成
4.反转录酶是一种（C ）
A. 依赖DNA的DNA聚合酶
B. 依赖DNA的RNA聚合酶
C. 依赖RNA的DNA聚合酶
D. 依赖RNA的RNA聚合酶
5.II 类限制性内切核酸酶( A )
A．仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供
B．限制性识别非甲基化的核苷酸序列
C．有外切核酸酶和甲基化酶活性
D．仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供
6.下面几种序列中你认为哪一个（哪些）最有可能是II 类酶的识别序列(C)
A.GAATCG
B.AACCTT
C.GATATC
D.ACGGCA
7、（多选）在基因工程中，可用碱性磷酸酶( AB )。
A．止DNA 的自身环化
B．同多核苷酸激酶一起进行DNA 的5’端标记
C．制备突出的3’端
D．上述说法都正确
8.K1enow 酶与DNA 聚合酶相比，前者丧失了( C )的活性。
A．5’→3’合成酶B．3’→5’外切酶
C．5’→3’外切酶 D ．转移酶
9.自然界中存在的植物植物基因工程载体是（D）
A.YAC
B.根癌农杆菌
C. Puc18
D.Ti质粒
10．质粒具备下列特征，因此适合作为克隆载体，除了(B)。
A．赋予宿主细胞某种可检测的特性
B．甲基化防止宿主的限制性内切核酸酶对其降解
C．独立复制的能力
D．可复制自身DNA 以及插入的外源DNA
11．用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为(C)。
A．染色体DNA断成了碎片
B．染色体DNA分子质量大，而不能释放
C．染色体变性后来不及复性
D．染色体未同蛋白质分开而沉淀
12.DNA提取过程中，异戊醇的作用是(D)。
A．使蛋白质脱水B．使DNA脱水
C．帮助DNA进入水相D．减少气泡，促进分相
13.PCR反应的必备条件是(B)。
A.至少有100个起始DNA分子B．拟扩增的目的DNA片段的部分序列信息C.扩增需要cDNA模板 D.至少100kb长度的模板
14.你打算扩增下面所示的两段序列之间的DNA，
5’-GACCTGTGGAAGC----------------------CATACGGGATTG-3’3’
-CTGGACACCTTCG-----------------------GTATGCCCTAAC-5’最适合的引物序列是（B ）。
A．引物1，5’-CTGGACACCTTCG 引物2，5’-GTATGCCCTAAC
B．引物1，5’-GACCTGTGGAAGC 引物2，5’-CAATCCCGTATG
C．引物1，5’-CGAAGGTGTCCAG 引物2，5’-GTTAGGGCATAC
D．引物1，5’-GCTTCCACAGGTC 引物2，5’-CATACGGGATTG
15、Southern 印迹是用DNA 探针检测DNA 片段，而Northern 印迹则是( C )。
A．用RNA 探针检测DNA 片段B．用RNA 探针检测RNA 片段C．用DNA 探针检测RNA 片段D．用DNA 探针检测蛋白质片段
四、简答题（5题×6）
1、基因工程的操作步骤是什么？制备目的基因方法有哪些？（或CTAB、SDS 原理？）答：1.获取目的基因2.从大肠杆菌中分离质粒3.酶切目的基因与质粒4.DNA连接酶连接目的基因与质粒5.导入受体细胞表达6.筛选与鉴定
获取目的基因方法：（1）以氨基酸序列为基础的功能克隆法（2）以核苷酸序列为基础的同源序列克隆法（3）基因组DNA文库（4）cDNA文库（5）图位克隆法
（6）转座子标签法（7）T-DNA插入法（8）mRNA差异显示法（9）化学合成法
（10）直接分离法（11）PCR分离法
2、何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？
答：将外源DNA 或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。
载体应具备：①在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）；②必须具备合适的酶切位
点，供外源DNA 片段插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于筛选；④其它：有一定的拷贝数，便于制备。
⑤遗传稳定
3、影响限制性内切酶的活性因素？
答：①DNA的纯度②DNA甲基化程度③DNA的分子结构④限制性核酸内切酶的缓冲液⑤酶切消化反应的时间和温度⑥反应体积和甘油浓度
4、简述cDNA文库的构建过程。
答：⑴细胞总RNA的提取和mRNA的分离
⑵第一链合成：由mRNA到cDNA的过程为反转录，由反转录酶催化。
⑶第二链合成：①自身引物合成法②置换合成法③引导合成法④引物—衔接头合成法
⑷双链cDNA里连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中繁殖
5、常用的工具酶有哪些？其主要用途是什么？（备选）
答：限制性内切核酸酶,DNA聚合酶和Klenow大片段,DNA连接酶,
碱性磷酸酶,末端脱氧核苷酸转移酶.
限制性内切核酸酶：能够识别特异的DNA碱基序列，DNA碱基序列往往呈回文对称结构；
DNA 聚合酶 a 位于细胞核内，也许是复合物，有催化细胞增生的作用；Klenow大片段：它也可以通过基因工程得到，分子量为76kDa 。
DNA连接酶：负责双链DNA中相邻3`-OH与5`-磷酸基团之间的磷酸二酯键的形成。
碱性磷酸酯酶：从DNA或RNA的三磷酸核苷酸上除去5`磷酸根残基。
末端转移酶的作用是将脱氧核糖核苷酸通过磷酸二酯键加到DNA分子的3`-OH末端。
6、重组分子筛选方法有哪些？并简述蓝白斑筛选原理。
（或基因工程在工农商的应用）
答：重组体的筛选方法：1 遗传表型筛选法2 结构特征筛选法3 核酸分子杂交筛选法4 免疫化学筛选法。
蓝白斑筛选原理：-半乳糖苷酶基因（Lac Z），其上有外源DNA的插入位点。
受体菌基因-IPTG诱导表达。
载
-半乳糖苷酶。
互补而产生的lacZ+细菌在诱导剂IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）存在时产生蓝色沉淀物，使菌落显蓝色。
如果外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，无法实现互补，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
五、综合论述（15分）
现有pBR322质粒载体，你想将小鼠（真核）中的一个序列已知、编码单体酶蛋白的基因在大肠杆菌（原核）中表达，怎样进行？你又如何确保最终能得到产
物? 请设计实验详细说明。