A中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及 塑料管。但每批微量反应板对抗原或抗体蛋白质的吸附性 能是有显著差别的。实验证明，吸附效果似乎与塑料的类 型及其表面性质有关。特别是塑料制品在加工过程中因工 艺不同或受其他因素的影响而造成吸附性能的极大差异， 甚至完全丧失吸附能力。因此，对每批制品在使用前，必 须经过实验室鉴定 。
免疫标记技术 = 免疫技术 + 标记技术
酶
抗原抗体反应
特异性
示踪物标记
灵敏性
荧光素
同位素
免疫标记技术的主要特点： 高度特异性、高度灵敏性
免疫标记技术
放射物标记技术
酶标记技术
免疫荧光技术
其他标记技术
酶联免疫吸附技术
酶免疫组化技术
酶免疫技术(enzyme immunoassay)
是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反 应相结合而建立的一种免疫检测技术。 就是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原 或抗体的一种免疫学标记技术。
1、所有样品按传染源处理； 2、加试剂前应混匀，力求滴加准确； 3、加样应加在板孔的底部，避免产生气泡并迅速完成； 4、洗涤时各孔均需加满，洗涤必须彻底，防止产生假阳性； 5.温育的时间要严格控制。
自习
五、 ELISA的影响因素
（一）固相载体 （二）抗原 （三）试验样品 （四）结合物 (五）洗涤剂与稀释剂 （六）底物 （七）作用时间 （八）结果判断 (九)试验的重复性（精确度） （十）对使用仪器要求
ELISA的基本原理有三条：
（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，是 蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保 持其免疫学活性； （2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物， 而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底 物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜 色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比 例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
酶联免疫吸附实验
一、实验目的
• 掌握酶联免疫吸附实验（ELISA）的原理
• 熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法
• 了解其他免疫标记技术
二、实验原理
免疫学分析方法发展很快，特别是在使用 标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使原来 许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都 不能相比。继50年代的免疫荧光（IF）和60年 代的放射免疫(RIA)分析技术之后，在70年代 初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技 术（酶免疫技术）。
（十）对使用仪器要求
所用仪器如吸管、烧杯试管都要清洁，用于酶 结合和底物的吸管和容器一定要分开。试剂要 求标准化
六、ELISA的应用
ELISA应用的范围很广，而且正在不断地扩大，原则上 ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直 接定量测定体液中的可溶性抗原。酶免疫试验（EIA） 结合光学显微镜或电子显微镜可进行抗原定位与结 构的研究，用酶标记抗原或抗体结合免疫扩散及免 疫电泳可提高试验的敏感性。在实际应用方面可作 疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、 兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。因此，它 和生物化学、免疫学、微生物学、药理学、流行病 学及传染病学等方面密切相关 。
(一):检查抗原和半抗原方面
1.内分泌方面已经用于检测雌性激素、绒毛膜 促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促 甲状腺素和孕酮等，其敏感性与RIA相当 2.在血液学方面可用于检查凝固因子（如第Ⅷ 凝固因子）、红细胞抗原及结合球蛋白 （Hapto Globin）等 3.在肿瘤方面已试用检查甲胎蛋白（AFP）癌 胚抗原（CEA），对前者的敏感性已达到与 放射免疫试验相当的水平，但对CEA检查的 敏感性较低，目前尚不能用于常规诊断
(二)测定抗体方面：所用的方法称为间接法， 也 是目前最常用的方法.
三、实验步骤
乙肝病毒存在三对抗原抗体系统 1.即表面抗原（HbsAg）和表面抗体（抗-HBs）、 2.e抗原（HBeAg）和e抗体（抗-HBe）、 3.核心抗原（HBcAg）和核心抗体（抗-HBc）
因核心抗原主要存在于肝细胞中，血清中不能表达，检测困难， 故只能检测二对半而不能检测三对，所以称为二对半。 HBV感染后的血清学指标: HBsAg, HBsAb HBeAg, HBeAb HBcAb(IgG,IgM) 乙肝表面抗原，存在于HBV感 染者的血清中,为感染指标之 一。
（八）结果判断
ELISA的试验结果可用肉眼观察颜色反 应的深浅作出判断，也可用分光光度计作 精确测定。当然,后者更为正确。而肉眼观 察更为简便，而且也有一定正确性。 不论用哪种方法判定结果，每次都 要有阳性和阴性参考血清作对照，这样可 以消除一些外界的影响因素。
(九)试验的重复性（精确度）
记录结果有下列几种方法： 1、“+”或“-”：所有超过规定的O.D值（如O.D，0.4） 的标本均属阳性，此规定O.D值是根据事先测定大量阴 性标本所取得的，此规定值是阴性标本的上限。或者以 一组阴性标本O.D平均值加2～3个标准差作为阳性阈值。 2、直接以O.D值来表示，如0.4、0.7、1.2，O.D值越 大，阳性反应越强，但此数值是在固定实验条件下得到 的结果，而且每次实验都要有参考标本作对照。 3、以终点滴度表示：将标本作连续稀释，最高稀释度 能出现阳性反应者（即OD值仍大于阳性阈值，即为该 标本的滴度。
（二）抗原
包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和 稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。如果不纯，由于抗原 中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性 和特异性。此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫 学活性。 对大多数传染病和寄生虫病的血清学诊断中所用的抗 原并非要求十分严格，一般能用于补体结合试验的可溶性 抗原均可用于ELISA。 对某些抗原必须进行提纯，如病毒的组织培养和鸡胚 培养物以及病毒接种动物的脏器等，它们当中存在着许多 非抗原的蛋白质，必须设法除去，常用梯度超速离心或亲 和层析法提纯，不经提纯是不能使用的。
（三）试验样品
血清、血浆或其他体液，均可作为ELISA的试验样品（标 本）。但应注意分离血清时，血液要求放置室温中凝固 收缩，不宜置冰箱（4℃）中凝固，否则会使大部分IgM 和少量IgG丧失活性。关于人血清在保存过程中抗体的稳 定性报导尚不多。但一般认为作ELISA血清最好要新鲜， 若要贮藏，必须少量分装保存于低温冰箱，并防止反复 冻融。血浆可用肝素毛细管法采血，而血清可用滤纸片 法采血。
（四）结合物
在ELISA中，用酶标记的抗体或抗原统称为结合 物，此为进行ELISA检测的关键试剂。常规使用 ELISA法的主要问题是能够简便地制备酶结合物， 而此种制备好的酶结合物要求稳定，具有很高的 酶活性，抗原或抗体的特异性，产量高及成本低。
（五）洗涤剂与稀释剂
加入牛血清白蛋白（BSA）和吐温—20抑制非 特异性蛋白的竞争性吸附作用。 它们有良好的封阻作用
实验材料
1.HBsAg诊断试剂盒 2.HBsAg抗原（阳性对照），阴性血清，待 检血清
微孔条已经包被HBsAb
1、编号：微孔条按顺序编号。 2、加样：分别加入待检血清、阳性血清、阴性血清各50ul， 空白对照。 3、加入酶结合物：每孔中加入酶结合物50ul，空白对照孔不加， 轻拍混匀。 4、温育：贴上胶纸，37℃温育30分钟。 5、洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完往后扣干（每次保持 30-60秒的浸泡时间）。 6、显色：每孔加底物A、B各50ul，轻拍混匀，封口，37℃暗 置10-15分钟。 7、终止：每孔加终止液50ul，轻拍混匀。 8、测定：用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值，并记录结果， 读数在加终止液10分钟内完成。
（六）底物
（1）底物在未被酶催化以前应该是无色的， 而经 酶催化后有明显的颜色变化，这样可 使结果分辨清楚； （2）所显色泽易干洗脱； （3）显色后的产物要求稳定，在作定量测定 时所产生的有色物质应该是可溶性的； （4）价廉，易得而且无毒。
（七）作用时间
(1) 任意确定一个时间，如20分钟或30分钟终止反应，测 定被检标本和阳性参考标本的O.D值。这样所得的数据要进 行校正，校正可按下列公式： 校正后O.D绝对值=被检标本的O.D值*（1.0/阳性标本的 O.D值） (2) 制备好一批酶结合物后预试时间，在反应温度固定时， 当阳性参考血清O.D值达到1.0时终止反应，记录这个时间， 如30分钟，以后用本批酶结合物测定待检样品时都采用同 一时间终止反应，这个办法不需要校正，比较方便。
Ag + AbE
AgAbE + 底物 呈色反应
酶联免疫吸附试验ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）
是一类常用的酶免疫技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固 相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。 ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种 病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面 的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量 测定。 ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操 作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之 内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行 病学调查。 本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环 抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。
4 、以“比值”表示：求出被检标本的 O.D 值与一组阴性标 本O.D值的比值，例如为阴性标本的2倍或3倍，即为阳性， 比值小于2.1而大于1.5为可疑，<1.5为阴性。 测定标本O.D值-空白O.D值 —————————————≥2.1 阴性对照O.D值-空白O.D值 如在此测定时以空白校正“O”点。 5、以“单位”来表示：在测定被检标本的同时，再测定一 个含已知单位数的阳性参考血清，用不同稀释度作ELISA检 测后，以O.D值为纵坐标，单位数为横坐标，画出标准曲线。 以后可根据被检标本的O.D值，从曲线上找出相应的单位数， 再乘于血清的稀释倍数，即可得出被检标本的单位数。