传代细胞培养实验
费求：
掌握无菌操作技术。 了解传代细胞的培养的一般方法与步骤。 了解培养细胞的消化分散。 了解培养液配制方法。 了解倒置显微镜的使用。
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实验原理：
细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单
细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、
繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分
配制培养液需要滤菌装置：除菌器、真空 泵以及0.45μm或0.22 μm的滤膜。
培养液应贮藏在4°C冰箱中。
配好的培养液应在无抗菌素的无菌条件下 进行培养，每次配好后留样，培养72小时， 观察培养液确实没有污染后使用。
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学习传代细胞的培养技术
本次试验应用HeLa细胞或A375-S2细胞 进行传代培养。
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（3）使用超净台的方法，在每次使用前，应用紫外 灯照30分钟。首先打开吹风的开关，在关掉紫外 灯，打开日光灯。点燃酒精灯，开始操作。
（4）超净台表面的处理。
a. 应做到每日清洁，以使操作中溅出的培养液或其 它液体及时被清除而不蓄积，达到杜绝细菌和真菌 繁殖的目的。
b. 工作台中只限放置每日工作所必需的物品，其他 非必须物应当除去。
目前，动物细胞培养技术已经达到一个新的阶 段：从不同分化组织衍生得到的许多类型的细 胞能够成功地在培养液中生长、反复传代。在 维持一个独特细胞系长达数月的过程中，记录 下细胞的倍增次数和生长速率是很有用的，以 便在合适的时间传代以及在体外生活是中不同 时间冻存细胞。
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实验内容：
1.工作环境及表面的处理（超净台的使用）
装吸管或吸头的容器也不应该在工作区以外打开。
细胞培养中液体的吸取，均需机械移液装置移取。 切勿采用口吸的方法。口吸是最大的微生物污染源， 更重要的是细胞培养液及成分通过食入或吸入的方 式及入人体，可能对研究人员造成伤害。
细胞培养瓶在超净台中打开后，瓶盖应扣在工作台 上。
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如果培养的细胞已经被污染，切勿直接倒掉，应高 压灭菌后倒掉处理。
不宜进行高温高压灭菌的器材，可以浸泡 在70%乙醇中进行消毒，并在超净台上 吹干。
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3.实验者的操作技术
无菌操作的原则：保证细胞培养板，细胞培养皿， 细胞培养瓶内部以及吸管包裹层等内部的无菌状态。
细胞培养应在超净工作台或有空气滤过装置的工作 间里进行。
培养液或其它溶液不应该在工作区以外打开。
可以向培养液中加入抗生素，比如青霉素， 链霉素，庆大霉素等，抑制由于操作中的微 小失误而导致的低水平的感染。但是，有时 由于抗生素的加入，也会使感染不易被迅速 发现。
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培养液的配制：
商家一般以三种形式提供培养液：1.粉末 剂 （需要实验着配制）2.浓缩装（用无菌 水稀释即可）3.无需进一步处理的工作液 形式。由于粉末剂是其中最便宜的一种， 一般实验室较多采用。
为了防止交叉污染，原则上超净台中应不同时进行 二种细胞系或细胞株的操作。
不应用的细胞应及时丢弃处理，不应继续放置于培 养箱中不予理睬。
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4.细胞的处理以及维持细胞生长所需培
养液的无菌处理。
基本培养液由必须氨基酸、维生素、无机盐、葡 萄糖和作为生长因子、激素和贴壁因子来源的血 清组成。一般用碳酸氢钠（NaHCO3)体系进行 缓冲。
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培养液的pH值应为7.2至7.4。
高密度细胞使细胞培养液中葡萄糖耗竭并产 生CO2和乳酸，在含酚红作为指示的培养液 中，培养液将从红色变为橙色。细胞培养液 长时间贮藏在4°C冰箱中，会使培养液的 pH值产生变化，变碱，是培养液的颜色呈深 品红紫色。应用时可用Hepes（N-2-羟乙基 哌嗪-N’-2-乙磺酸）调整。
* 早期细胞培养，依靠的是精湛的操作技术和尽可能的靠 近火焰一达到细胞的无菌化。
* 目前，超净台是使工作台无菌化最经济有效的手段。
（1）超净台的选择，应选择层流超净台。不能选择平流 超净台。超净台应该尽可能的安装紫外灯。
（2）超净台的维护，超净台的HEPA过滤层应该每一年 或一年后由认可的机构进行维修。
c. 日常的清洁工作包括：用70%的酒精或10%的 新洁而灭擦洗工作台。用固定的容器装废弃液。
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2.细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理
用于细胞培养的器材包括：细胞培养瓶， 细胞培养板，吸管，各种瓶子等。
目前，上述器材均可以从商家买到无菌一 次性的用品。但是，成本太高。
玻璃器材，经过湿热或者干热灭菌后可以 反复使用。
细胞的生长不仅产生CO2，也需要CO2才能生存。 所以，细胞的培养需要子在CO2培养箱中
CO2培养箱中CO2的浓度应与培养液中碳酸氢钠 平衡。如果CO2的浓度为5%，则配培养液中应 加入1.97g/L的碳酸氢钠。
培养瓶盖应轻轻的拧上，不要完全拧死，以保证 气体的交换。
培养液的pH值应为7.2至7..4。
裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，
死亡等生命现象。还可以利用培养细胞制备染
色体，分析外界因素（如理化因素）对细胞的
影响，研究细胞癌变等等。在细胞培养的基础
上发展了细胞融合、细胞杂交等细胞工程技术
及单克隆抗体技术。
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动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。直 接从有机体获取的细胞进行的培养是原代培养， 若将培养细胞洗脱后转移到另外的容器中进行 在培养叫做传代培养。
HeLa 细胞：人子宫颈癌细胞株 A375-S2细胞：人黑色素瘤细胞株
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操作前的准备（超净台内物品摆放）
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实验材料：
每组的超净台中有以下物品： 1. 20mlRPMI1640培养液1瓶；1-2ml小牛
血清（FCS) 1瓶；2ml胰蛋白酶 1瓶；1ml 谷氨酰胺 1瓶；1ml Hepes 1瓶；PBS(-)1 瓶 2. 1ml ，200μl移液器各1支；枪头盒2个 镊子1把，小烧杯1个；酒精灯1台； 培养好细胞的细胞培养瓶1个
湿润的培养箱是常见的污染源。通常由充满液体的 托盘提供培养箱合适的湿度，然而托盘本身及可导 致各种细菌和真菌的污染，这种污染还可能存在与 培养箱壁上和提供气体的管道上。应该定期对培养 箱进行加热处理。也可以采用70%乙醇擦洗表面， 并定期更换输送CO2管道，并将该管子浸泡与 20%的含氯漂白剂中消毒。