分子信标：新型核酸分子探针摘要：分子信标是基于荧光共振能量传递原理设计的一种发夹型寡聚核酸分子荧光探针，能够与待测核酸序列分子相互作用发生结构变化产生不同强度的荧光信号及电化学信号等，具有高灵敏度、高选择性、适于活体检测等优点。
本文介绍了分子信标的作用原理，不同的分子信标类型以及应用，最后对前景作出了预测。
关键词：分子信标荧光探针灵敏度选择性活体检测引言：从20世纪60年代初至今，分子信标（Molecular beacon,MB）已被广泛地应用于生物、药物、化学等多个领域【1,2,3,4】。
近年来，MB特别是基于DNA结构的MB，已成为一种重要工具，用于核酸的复制、重组、翻译和表达的研究【5,7,12】。
为了满足后基因组时代的发展需求，人们通过各种分子工程策略，发展了许多敏锐性更高、选择性更优的MB。
自从1996年Tyagi和Krame【6】首次建立了分子信标探针，由于其独特的性质和多功能性，如操作简单、灵敏度高、特异性强等。
在它出色地完成了液相靶标测定(实时PCR测定)任务之后，人们又将其应用于核酸实时定量测定、活体分析、化学与生物传感、疾病基因检测与诊断等研究中【8,9,10,11】。
又由于易于对其进行修饰和改性，在这十来年的发展中，人们在经典分子信标模型的基础上，设计出了许多新型的分子信标，如无茎分子信标，用PNA【13】链代替ssDNA形成的PNA分子信标，以及LNA分子信标等。
这些新型的分子信标是为了满足不同的需要而设计的，特异性更强，稳定性更好，为许多新的研究领域提供了一个平台。
为了满足基因组学和蛋白质组学的发展，对分子信标的固定化也成了必然的发展趋势，自从谭蔚泓【14】首次将分子信标固定在硅胶上以来，固定化分子信标也迅速发展起来。
尤其是后来设计的将分子信标固定在金表面【15,16】，利用金的强摩尔消光系数进行淬灭，简化了分子信标的设计，更加方便对其进行操作，大大促进了基因微阵列技术的发展。
1 分子信标的结构和作用原理分子信标的结构(图1)：分子信标是一种设计巧妙的荧光探针。
常规的分子信标是由一段包含了茎一环结构的单链寡聚核苷酸组成，形成一个发夹型结构。
在其环状部分，一般是一段长度为15—30碱基的序列，能与目标分子特异结合，茎区是长度为5—8碱基的互补序列，茎区的两端分别连接有荧光基团和淬灭基团。
为了保证分子信标的灵敏度和热力学稳定性，在其茎干区设计的碱基数目一般为其环区的一半。
过长，则灵敏度下降；过短，则稳定性下降。
由于分子信标杂交前后环状区与目标分子的双链结构之间存在热力学平衡关系，使它的杂交特异性明显高于常规的线状探针。
近来，Dubertret等【17】用金纳米粒子簇代替DABcYL做淬灭剂，可以通过调节金纳米簇的形状、大小和组成而得到不同的淬灭剂。
由于金纳米簇对荧光试剂有着更高的淬灭效率，所以用金纳米粒子代替DABcYL后，大大提高了分子信标的灵敏度和特异性。
其它的淬灭基团还有铜离子螯合物【18】、超分子淬灭剂【19】以及直接利用碱基【20】本身做淬灭剂等。
图1 典型分子信标结构另一种结构的分子信标是无茎分子信标。
与经典分子信标结构类似，无茎分子信标只是不再含有双链结构的茎杆区，只含有单链的环状结构，具有很好的柔韧性。
目前的无茎分子信标有PNA【21,22,23】和DNA【24,25,26】两种，自由状态时，由于荧光分子与淬灭分子之间的疏水作用使得无茎分子信标近似于一个闭环结构。
当分子信标与靶序列结合后，探针与靶标形成的双链由于具有刚性使得荧光分子与淬灭分子分开，荧光恢复。
无茎分子信标与标准分子信标相比，由于其柔韧性增加，所以在体系中检测时，对靶标的响应加快，特异性也增强，又因为其不需要茎的结构，在设计和合成上相对简单，成本降低。
但其结构上缺少了茎区，稳定性有所下降，背景荧光相对增强。
分子信标作用原理：在自由状态下，分子信标以发夹结构存在，茎区的碱基互补配对，使连接在探针的5’端荧光基团及3’端的淬灭基团相互接近(约为7—10 nm)。
当一定波长的激发光照射时，荧光分子和淬灭分子之间发生荧光共振能量转移。
荧光基团受激所产生的荧光被淬灭基团吸收，并以热量的形式散发，荧光几乎完全淬灭，此时荧光背景极低(如图2)。
加入与环状区互补的靶核苷酸序列后，分子信标可与之形成相对刚性并且更加稳定的双链体，使茎干区的互补链被拉开，从而使得荧光基团与淬灭基团分开，空间距离增大，根据Forster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。
杂交后，分子信标的荧光几乎完全恢复。
并且荧光强度与溶液中靶标序列的量成正比，所以可以用来作定量分析。
图2. 分子信标作用原理2 分子信标的类型2.1 双重荧光共振能量转移(FRET)分子信标双重荧光共振能量转移(FRET)(图3)分子信标【27】是指在一个体系中同时设计了两种分子信标，只有通过这两种分子信标的相互作用才能实现检测。
其中一个分子信标包含一个荧光给体基团和一个淬灭基团，另一个分子信标包含一个荧光受体基团和一个淬灭基团。
在自由状态时，荧光给体基团和荧光受体基团都处于荧光淬灭状态，当在体系中加入目标分子时，这一对分子信标同时打开，荧光给体基团与荧光受体基团头对头地与目标分子特异性结合，此时，两基团彼此挨得很近(<6 nm)，发生荧光共振能量转移，给体分子将能量传递给受体分子，受体分子获得能量发出特征荧光。
通常用来做荧光给体的是镧系元素螯合物，有机荧光团作为荧光受体。
因为镧系元素螯合物的荧光发光寿命很长(约1 ms)，发出的光的带分布很窄，在某一些波长区域，几乎不发荧光，而且还能有效地降低荧光受体基团、实验中干扰物以及池子自身的荧光，使得在某一些波长区域的背景荧光几乎接近零，大大地提高了信噪比，从而提高了检测的灵敏度，所以很适合于作为荧光给体材料。
因为常规的分子信标用于活体检测时，由于细胞内的环境比较复杂，如可能被细胞内的核酸酶降解或非特异性地与核酸结合蛋白结合，而导致假阳性信号。
但采用这种双重荧光共振能量转移(FRET)分子信标，因为只有当荧光给体基团与荧光受体基团同时发生杂交时，才能发出受体基团的特征荧光，所以能大大地减小假阳性信号。
与以前的双线型探针相比，采用这种方法能显著地降低由于光谱重叠而产生的高背景信号，提高检测灵敏度，还能区分单碱基多态性【28,29】。
因此，这种分子信标将会成为基因表达实时监测，活体细胞定量检测的有力工具【30,31】。
图3 FRET双分子信标2.2超级猝灭基团分子探针(SQ-MB)SQ-MB是一个一端具有多个猝灭基团的荧光分子探针【32,33】，如图4所示。
近年来，MB被广泛地应用于生物技术研究的各个领域。
但由于MB结构中的荧光基团不能被有效地猝灭，较高的背景噪音严重影响了实际应用过程中测试结果的准确性。
因此，通过结构的优化以降低体系的背景噪音越来越受到关注。
据报道，应用多个猝灭基团与一个荧光基团配对，可以有效地提高猝灭效率。
这是由于多个猝灭基团可以提高吸收效率、增强猝灭基团与荧光基团问的偶极一偶极配位能力，从而提高猝灭效率。
图4 包含3个淬灭基团的分子信标2.3 锁定分子信标随着分子生物学的发展，对分子信标的应用也不仅仅限于体外检测。
活体检测是目前发展的一个很重要的方向，但由于活体内的环境比体外要复杂得多，如活体内存在的核酸酶能快速地将常规的分子信标分解，造成假阳性信号。
对分子信标进行修饰【34】就是为了有效地避免核酸酶等外在物质的影响而进行的。
而锁定分子信标正是为了满足这一发展需求而设计的一类稳定性、选择性和灵敏度都非常高的核酸探针。
LNA【35,36】是将核苷酸中的核糖的2’一O和4’一C用一个亚甲基连结起来，形成一个核糖双环结构，改变了它的几何和立体性质，减小了核糖结构的柔韧性，从而显著地提高了它的稳定性。
但修饰后的核酸依然保持了双螺旋结构，对互补链的亲和度不受影响，在水中的溶解度也能保持一样，还因其带有一定的负电荷，用带正电荷的脂质体就能很容易地将其导入细胞内，且它的合成方法也与合成DNA的方法类似。
因此，鉴于LNA的上述性质，在实验室用LNA操作起来就比DNA方便，能够简化实验过程。
图5 LNA/2′-O-methyl RNA探针Irina【37】等用LNA/2′-O-methyl RNA嵌合探针用于活细胞中mRNA中的动态成像。
实验结果表明该方法与普通的分子信标相比，与mRNA的杂化率更高。
2.4 无茎分子信标在实际的检测中，荧光基团和淬灭基团仅仅只是一个辅助基团，真正起识别作用的只是分子信标的环状部分。
无茎PNA能快速地与目标链结合，减少检测时间，并且在复杂的体系中也能保持相对的稳定性。
如将其与PNA 结合使用，还可用于DNA和RNA的检测，背景信号低【38】(图6)。
图6 stemless FIT–PNA beacons in the detection of complementary nucleic acids2.5 荧光波长转移型分子信标图7 荧光波长转移型分子信标在常规的分子信标基础上，Carolin【39】等设计了另一种分子信标。
他们在分子信标茎部加入两个发色团噻唑橙和噻唑红作为人工碱基，两者间可发生能量转移，用490nm的光照射，发射峰在670nm，由绿光变为红光，然而当该分子信标与目标链结合后，荧光降为530nm，该方法的优势在于不需要淬灭剂，而且背景信号低。
3 固定化分子信标分子信标对靶序列的检测尽管十分灵敏，但早期发展起来的分子信标都是用于液相中的检测，这样就限制了分子信标在活体生物医学研究和DNA生物传感中的大规模应用。
但如果能将不同序列的多种分子信标固定在固体基片表面，并保持其原有性质不变，无疑将可用于DNA的大规模并行检测，大大提高分析效率。
而目前固定化的分子信标从检测方式上来分有基于荧光和基于电化学的两种。
3.1 基于荧光检测的固定化分子信标这一方向的固定化分子信标开展得相对较早，而且在这几年的发展中也取得了不小的进步。
谭蔚泓等【14,41】于1999年首次通过生物素一抗生物素蛋白将分子信标固定在硅片表面(图8)。
他选取靠近淬灭基团的茎干区做固定点，将生物素标记到ssDNA上，因为这样对分子信标的荧光、淬灭以及杂交影响最小，再将标记好的分子信标连接到标记有亲和素的硅胶表面。
为了尽可能地减小固定化的分子信标产生的光漂白现象，他们采用罗丹明作为荧光基团。
这种固定化的分子信标可以用于均相液态环境以及固液界面等较为复杂的环境中，其杂交能力，亲和性等性质基本不变，能检测到的靶序列浓度达纳摩尔级。
图8 固定化分子信标3.2 基于电化学检测的固定化分子信标分子信标的荧光检测方法在过去的十来年中在实验室已经取得了很大的发展, 然而，固定化分子信标用于电化学检测也有报道。